Les techniques d'étude : la cytogénétique moléculaire Principe de la technique Différents types de sondes sont utilisées Principales applications de l'hybridation in situ

1. le principe de la FISH = Fluorescence In Situ Hybridation 1) L’ADN cible : ADN sur lequel est faite l’hybridation - In situ : les chromosomes 2) Une sonde : ADN ou ARN marqué - fixation de fluorochromes sur la sonde à sonde fluorescente 3) Hybridation de l’ADN cible avec une sonde = Etablissement de LH entre la sonde fluorescente et l’ADN cible à ADN cible fluorescent 2

1) Principe de la technique Le principe repose sur l'utilisation d'une sonde moléculaire, c'est-à-dire une petite séquence d'ADN (ou d' ARN ) dont l'emplacement normal est connu dans le génome et qui est marquée chimiquement de façon à pouvoir être repérée par la suite. Cette sonde est mise en contact avec les chromosomes d'une mitose (ou de noyaux interphasiques) et va s'hybrider (se fixer) spécifiquement au niveau de sa séquence complémentaire. On peut alors visualiser la sonde au microscope dont l'emplacement identifie précisément la région chromosomique dont elle est complémentaire.

Les sondes sont marquées soit avec une molécule fluorescente, soit avec un haptène (molécule qui peut être reconnue par un anticorps). Dans le premier cas, la sonde est directement visible au microscope à fluorescence, tandis que dans le second, une étape supplémentaire de révélation avec un anticorps fluorescent est nécessaire.

1. principe de la FISH : Les principales étapes d’une FISH 1 Etape de codénaturation - sur plaque chauffante - dénaturation des chromosomes - dénaturation de la sonde 2 Etape d’hybridation à 37°C pendant une nuit - fixation de la sonde sur les chromosomes - renaturation progressive des chromosomes et de la sonde 3 Lavages - élimination de l’excès de sonde non fixée sur les chromosomes à Augmentation de la spécificité 4 Contre-coloration des chromosomes avec le DAPI - agent intercalant entre les bases de l’ADN - fluorescent 5

1. le principe de la FISH : lecture lecture avec un microscope à épifluorescence 6

2. Applications de la FISH : différentes sondes 1) Peinture chromosomique à un chromosome ou un bras chromosomique 2) Sondes spécifiques d’une région chromosomique - sondes locus spécifiques à régions impliquées dans un syndrome (plusieurs gènes) -> aneuvysion : chromosomes 13 et 21 - sondes centromériques (CEP) -> aneuvysion : chromosomes X,Y et 18 -> les centromères de tous les chromosomes - sondes télomériques (tel) -> télomère du bras court -> télomère du bras long 7

2) Différents types de sondes sont utilisées : Sondes centromériques : elles s'hybrident au niveau des centromères des chromosomes. Les séquences dont elles sont complémentaires sont naturellement présentes en un grand nombre d'exemplaires au niveau des centromères ; le signal obtenu est donc en général intense car la sonde s'hybride sur chacune des séquences complémentaires présentes. Ces sondes sont surtout utiles pour dénombrer les chromosomes, aussi bien en métaphase qu'en interphase et pour identifier l'origine de chromosomes marqueurs

Satellite (centromere) probe – chromosome 7

Le diagnostic prénatal pour le syndrome Down par FISH dans les amniocyites (les cellules foetales ).

Sondes de peinture chromosomique : elles sont constituées d'un ensemble de sondes de petite taille qui couvrent l'ensemble du chromosome. Ces sondes sont obtenues après isolement et marquage de l'ADN d'un chromosome ; leur réalisation ne nécessite pas de connaître la séquence de cet ADN. Après hybridation , on observe un marquage de tout le chromosome. Il existe également des peintures spécifiques d'un bras ou même de quelques bandes chromosomiques. Ces sondes sont très utiles pour interpréter certaines translocations complexes, mettre en évidence des échanges de petite taille, identifier précisément l'origine d'un fragment non identifié.

Sondes locus spécifique : comme leur nom l'indique, ces sondes de petite taille permettent d'identifier une région très précise du génome. Elles sont obtenues par marquage de l'ADN cloné dans différents vecteurs (plasmides, cosmides, YACS, BACs...). Leur intérêt principal réside dans la mise en évidence rapide de remaniements impliquant une région chromosomique précise ( microdélétions , translocations, inversions ...)

Del 22q -del

Sondes telomeriques

3) Principales applications de l'hybridation in situ ( FISH pour les anglo-saxons : Fluorescence In Situ Hybridisation) : Dénombrement de chromosomes : mise en évidence d'anomalie de nombre des chromosomes, homogènes ou en mosaïque. Identification de l'origine d'un fragment chromosomique : chromosomes marqueurs, matériel supplémentaire d'origine inconnue sur un chromosome, remaniement complexes ou de toute petite taille. Mise en évidence de microdélétions, non vues sur le caryotype standard.

indication de la FISH aneuvysion à partir du liquide amniotique Indications - signes d’appel échographiques - nuque épaisse sur échographie du 1° trimestre 18 27

application de la FISH : diagnostic d’un syndrome microdélétionnel Signe d’appel échographique : cardiopathie caryotype normal Recherche d’un syndrome de DiGeorge Présence d’une microdélétion en 22q11 28

application de la FISH Identification d’un petit marqueur surnuméraire 29

application de la FISH : Identification d’un petit marqueur surnuméraire par FISH centromérique 30

application de la FISH délétion

application de la FISH délétion délétion du gène du rétinoblastome RB1

Satellite (centromerique) probe en X–chromosome 45,X or 46,XY Caryotype possible?

X- and Y-centromeric probes Vert = X Rouge = Y 46,XY Caryotype?

Interphase : X-centromerique probe Caryotype possible? Mosaic caryotype 45,X/46,XX 46,XY/46,XX 47,XXY/46,XY 45,X/47,XXY

X-centromerique probe – identification d’un chromosome marker Marker est un derivative du chromosome X; Possible caryotype: 47,XX,der(X) mar

Sonde locus specifique – SRY

Combinaison de sonde locus specifique avec de sonde centromerique Vert = X-centromere Rouge = SRY Les hommes normales - 46,XY; SRY est presente. Possible caryotype?

Rouge –TUPLE1 (HIRA) locus 22q Microdeletion 22q deletion – signal rouge absent Rouge –TUPLE1 (HIRA) locus 22q Vert- (control probe) normal chromosome – signal rouge locus est present Microdeletion 22q11.2 – le syndrome DiGeorge .

fantes palpebrales „antimongoloides“ DiGeorge syndrome fantes palpebrales „antimongoloides“ hypertelorisme micrognatie Malformation cardiaque (e.g. tetralogy Fallot), Hypoplasie(aplasie) thymique .

Tetralogy of Fallot Left normal heart, right heart of the patient with the tetralogy of Fallot Tetralogy of Fallot – combination of 4 different inborn cardiac defects

oncogene HER2/NEU -amplification ( signal rouge ) Normal Amplification

Painting probes – chromosomes 1, 4 et 8 Normal

Painting probes - translocation 11-21