Journée de Printemps de la FFCD Cancer du rectum Facteurs moléculaires prédictifs de la réponse au traitement néo-adjuvant Journée de Printemps de la FFCD Nantes, 16 juin 2006 Astrid Lièvre Hépato-gastroentérologie et Oncologie Digestive CHU Ambroise Paré, Boulogne Inserm U775, Paris

Traitement néo-adjuvant Radiothérapie ou radio-chimiothérapie Réponse au ttt néo-adjuvant: quelle définition? histologique clinique (imagerie) Foyers microscopiques de cellules tumorales au sein de la fibrose  RC T downstaging Biopsies pré-thérapeutiques: pour la prédiction de la réponse Pourquoi s’intéresser à la réponse au ttt néo-adjuvant? Réponse associée à Je ne reviens pas sur le type de ttt néoadjuvant indiqué dans le K rectum qui vient de vous être présenté et qui comprend évidemment la RT, mais aussi de + en + la RCT, comme c’est le cas dans la plupart des études dont je vais vous parler. Cette radiothérapie ou radio-chimiothérapie néo-adjuvante a fait la preuve de son efficacité en termes de diminution du risque de récidive locale et, tout du moins avant l’emploi de l’exérèse totale du mésorectum, d’amélioration de la survie réduction du risque de récidive locale meilleur pronostic (SSR et SG)

Intérêt des marqueurs prédictifs de la réponse au traitement néo-adjuvant Temps Coût Morbidité péri-op Effets 2aires/séquelles RT ou RCT néo-adjuvante INCONVENIENTS Préservation sphinctérienne Cette RT ou RCT néoadj est chronophage, va avoir un coüt, et entraîne des effets secondaires à court et des séquelles à long terme et augmente la morbidité péri-opératoire, sans oublier les séquelles sexuelles DONC seuls les pts répondeurs vont avoir un rapport bénéfice/risque favorable A l’inverse, ce ttt néoadj va permettre, en cas de réponse, de permettre dans certains cas une préservation sphinctérienne, et en tout cas une réduction du risque de récidive locale (voire métastatique) et une amélioration de la survie des pts, et j’ai rajouté de manière un peu provocatrice (et l’on sort du cadre strict du ttt néoadjuvant) se passer de la chirurgie dans les stades précoces, comme cela a été montré dans une étude récente (stade 0) RT ou RCT néo-adjuvante  récidives locorégionales AVANTAGES  survie Se passer de la chirurgie? Habr-Gama Ann Surg 2004; 240: 711-17

Effets moléculaires de la radiothérapie Radiations ionisantes Radicaux libres Cassures simple brin double brin Lésions de l’ADN Réparation de l’ADN Apoptose Effet thérapeutique

P53 Cellule normale Cellule endommagée p53 ubiquitine protéasome p53 Lésion de l’ADN, radiothérapie, chimiothérapie p53 Mdm2 ubiquitine protéasome Mdm2 p53 P kinases p53 p21 waf1/cip1 cyclines Cdk Progression du cycle cellulaire - Pas de transcription des inhibiteurs du cycle cellulaire p21 waf1/cip1 p53 P GADD45 Réparation de l’ADN Cdk Cd Progression du cycle cellulaire cyclines p53 P apoptose apoptose

P53

P53 Marqueur moléculaire prédictif le + étudié dans le cancer du rectum Protéine p53 fonctionnelle = marqueur de radiosensibilité des cellules tumorales in vitro Lowe Science 1994; 226: 807-10 22 études Hétérogénéité des techniques employées: - protéine: IHC (hyperexpression de p53) - gène: SSCP, séquençage direct (mutation de TP53) La majorité des études ont analysé l’expression de la protéine p53 en IHC cepdt pas de corrélation exacte entre hyperexpression de la protéine et mutation de p53

hyperexpression de p53 prédictive de non réponse Analyse expression protéique (IHC) Au moins 18 études répertoriées dans la littérature 4 études hyperexpression de p53 prédictive de non réponse réf Nb pts Ttt néo-adj Réponse (p53+ vs p53-) Spitz Clin Cancer Res 1997 42 RT-CT 47,8% vs 78,9%, p=0,02 RC: 13% vs 52,6%, p=0,005 Multivariée: p53- OR=10,6 (IC95:1,15-97,9, p=0,03) Fu Dis Colon Rectum 1998 49 RT 8% vs 66%, p < 0,001 p21+/p53- vs p21-/p53+ : 91% vs 4,5%, p < 0,001 (réduction taille tumeur : 49,5% vs 29%, p < 0,01) Luna-Perez Ann Surg Oncol 1998 26 28,5% vs 83%, p < 0,05 Komuro Hepatogastroenterology 2005 96 Univariée: p53- associé à réponse histo Multivariée: combinaison p53, p16, p21 et Ku 4 études ont trouvé une corrélation entre p53 et réponse MAIS: Hétérogénéité dans l’établissement du seuil d’hyperexpression de p53 Hétérogénéité du ttt néoadjuvant Hétérogénéité concernant lé définition de la réponse au ttt (histo, p), m^me au sein de l’histo Faible nb de patients inclus

P53 Recherche de mutation du gène par séquençage direct 2 études montrant une valeur prédictive des mutation de TP53 Rebischung Int J Cancer 2002; 100: 131-35 86 pts, RT préopératoire, biopsies préthérapeutiques Mutation TP53: 51% P53 muté P53 non muté p Répondeurs* (n=35) 12 23 < 0,01 Non répondeurs (n=51) 32 19 Répondeurs complets (n=10) 2 8 < 0,04 Peu d’étude disponibles ayant évalué les mutation de p53 mais 2 positives Rau et al JCO 2003: pas de corrélation entre mutation p53 et réponse ou DFS mais seulement 8/51 tumeur mutées (très faible) * Réponse = usT-pT ≥ 1

NB: hyperexpression p53 non prédictive Kandioler Ann Surg 2002; 235: 493-98 64 pts, RT préopératoire, biopsies préthérapeutiques Mutation TP53: 45% (hyperexpression prot en IHC: 61%) P53 muté P53 non muté p Répondeurs 14 < 0,0001 Non répondeurs 29 21 Mutation TP53 prédictive de non réponse à la RT et facteur de mauvais pronostic NB: hyperexpression p53 non prédictive

Hyperexpression de p21 prédictive de bonne réponse au ttt néo-adjuvant Transcription du gène p21 waf1/cip1 activée par p53 en réponse aux lésions de l’ADN induites par les radiations ionisantes 4 études, expression protéique de p21 en IHC Hyperexpression de p21 prédictive de bonne réponse au ttt néo-adjuvant Protéine clé dans la voie de p53 puisque sa transcription est activée… 4 études disponibles dans la littérature, dont les résultats sont convergents vers une corrélation entre hyperexpression de p21 et bonne répônse au ttt néoadj, c’est à dire qu’il existe une meilleure réponse des tumeurs p21+ ou que l’expression de 21 est + élevée en cas de réponse Ceci est logique puisque si on reprend le schéma général de la voie p53, on voit que + l’exp de p21 est importante, + il y aura inhibition de la progression dans le cycle cellulaire et activation du processus apoptotique donc efficacité des lésions de l’ADN induites par la RCT

expression p21 après RCT associée à une meilleure survie sans récidive High exp p21 Low exp p21 p =0,08 66 pts, RCT préop, réponse histologique % exp p21 préop (median) p réponse 59 15 < 0,05 non réponse 41 2,5 Analyse de l’expression « dynamique » de p21 (avant + après ttt néo-adjuvant) expression p21 après RCT associée à une meilleure survie sans récidive (SSR 5 ans: 63 vs 26%, p = 0,03)  p21  p21 p=0,03 Originalité c’est l’étude dnamique de l’expression de p21: diminution de l’exp de p21 après la RCT préop est associée à une meilleure survie sans récidive (DFS 5 ans 63 vs 26% en cas d’augmentation de l’exp de p21 après ttt) Rau et al J Clin Oncol 2003; 21: 3391-401

Activation de la cascade des caspases Bcl 2 et Bax Bcl 2 protéine anti-apoptotique  maintien de l’intégrité de la membrane externe de la mitochondrie Bax protéine pro-apoptotique induite directement par p53 ou d’autres stimuli pro-apoptotiques altération de la membrane ext mitochondriale Libération extra-mitochondriale de protéines pro-apoptotiques (cytochrome C) Activation de la cascade des caspases

7 études (Bcl 2), 2 études (Bax) analyse IHC Bcl 2 et Bax 7 études (Bcl 2), 2 études (Bax) analyse IHC Bcl 2: 1 étude « positive » Qiu Dis Colon Rectum 2000; 43: 451-9 72 pts , RT ou RCT (n=51) pré-op, réponse ypT et histo (RC) - Réponse p21+/Bcl2+ vs p21-/Bcl2- : 71% vs 31%, p=0,012 - Pas de corrélation entre Bcl 2 et réponse: 45 vs 34%, p=0,29 Bax: 1 étude « positive » Chang Hum Pathol 2005; 36:364-71 130 pts, RCT préop, réponse histo (5 grades) - Expression Bax RC vs RP/non réponse: 54% vs 29%, p = 0,017 - Analyse multivariée: Bax+ ORréponse = 4,75 (1,04-21,7, p=0,045) - Bax+: 53% (ypT0) vs 29% (ypT1-T4 ), p=0,014 Ttt postop eliminé Bax: corrélation entre exp de Bax et réponse histologique (attention ont comparé RC et RP cad tout ce qui n’est pas RC) Qiu Dis Clon Rectum 2000, Rodel Int J Radiat Oncol Biol Phys 2001, Rau JCO 2003, Scott Eur J Surg Oncol 1998, Kim Ann Surg Oncol 2001, Chang Hum Pathol 2005, Rodel Strahlenther Onkol 2002 , Okonkwo Oncol Rep 2001

forts taux d’apoptose « induite » par RT ou CT Etudes expérimentales chez la souris* forts taux d’apoptose « induite » par RT ou CT apoptose « spontanée » élevée corrélée Meilleure radiosensibilité Etudes cliniques  index apoptotique élevé prédictif de bonne réponse à la RCT néo-adjuvante Des études in vitro ont montré que de hauts tx d’apoptose spontanée etait corrélée à des tx d’apoptose inductible élévés et une meilleure radiosensibilité de lignées celluliare tumorales (Meyn Int J Radiat Biol 1993, Meyn Cancer Metastasis Rev 1996) Meyn Int J Radiat Biol 1993: analyse de l’apoptose de 15 tumeurs différentes chez la souris sacrifié à 3H et 6H après des doses croissantes de RT: les tumeurs au sein desquelles l’index apoptotique est le + élevé sont celles qui croissent le - vite et nécessite des doses TCD50 (dose to cure 50% d’animaux) moins importantes 6 études toutes positives MAIS hétérogénéité des méthodes d’étude de l’apoptose, 2 études avec RCT et hyperthermie * Meyn Int J Radiat Biol 1993; 64: 583-91, Meyn Cancer Metastasis Rev 1996; 15:119-31

Hyperexpression EGFR prédictive de mauvaise réponse à la RT-RCT Activation de la voie EGFR après exposition à des radiations ionisantes : effet protecteur cellulaire Hyperexpression EGFR associée à radiorésistance AC anti-EGFR (cetuximab): radiosensibilisant In vitro et in vivo* Giralt Int J Radiat Oncol Biol Phys 2002; 54: 1460-65 45 pts, RT ou RCT, réponse T IHC EGFR+ (>5%): 64% EGFR+ EGFR- p Réponse clinique Oui (n=20) Non (n=25) 10 (34%) 19 (66%) 10 (62%) 6 (38%) 0,07 RC histo Oui (n=7) Non (n=38) 1 (3%) 28 (97%) 0,003 Activation de la voie EGFR près exposition aux RI , phénomène considéré comme une réponse protectrice au stress cellulaire engendré par les RI Milas in vitro: Démonstration de la corrélation entre expression EGFR et réponse à la RT en transfectant un vecteur exprimant EGFR dans une lignée cellulaire murine exprimant faiblement EGFR. Par comparaison avec les cellules transfectées avec le vecteur contôle, l’hyperexpression de EGFR dans la lignée transfectées avec le vecteur EGFR était responsable d’une radiorésistance. Cette radiorésistance était corrigée par le ttt de la lignée avec l ’anticorps antiEGFR cetuximab. Lignées cellulaires et souris xénogreffées avec tumeurs donc in vitro et in vivo Hyperexpression EGFR prédictive de mauvaise réponse à la RT-RCT * Goldkorn Biochim Biophys Acta 1997; 1358: 289-99 Liang Int J Radiat Oncol Biol Phys 2003; 5: 246-54 Milas Int J Radiat Oncol Biol Phys 2004; 58:966-71

Cyclo-oxygénase 2 Implication de COX-2 dans la carcinogenèse colorectale Effet protecteur cellulaire des prostaglandines vis-à-vis des lésions induites par les radiations ionisantes Production tumorale de PGE2 associée à une radiorésistance  de la radiosensibilité tumorale par un anti COX-2 in vitro Expression de COX-2 corrélée à la réponse à la RT dans K larynx, col Phospholipides membranaires PLA2 Acide arachidonique COX-1 COX-2 PGG2 PGH2 Prostaglandines TXA2 Prostacyclines Cox2 est l’isoforme inductible de la cyclooxygénase, par des facteurs proinflammatoires et des facteurs de croissance Données expérimentales et chez l’homme en faveur de l’implication de la COX2 dans la carcinogenèse en règle générale, dans le carcinogenèse colorectale en particulier par son implication dans l’invasion tumorale, inhibition de l’apoptose, la néoangiogenèse, interférence avec la voie APC/bet-catenine et les inhibiteurs de COX2 ont un effet antitumoral dans des études expérimentales On sait que les cellules tumorales peuvent secréter de la COX2 et produire des prostaglandines, en particulier de la PGE2 après exposition à des radiations ionisantesafin de se protéger contre les lésions indiuites par ces dernières Enfin, des études cliniques ont montré une corrélation entre l’expression intratumorale de COX2 sur des biopsie préttt et la rponse à la RT ou RCT dans le K du larynx (petites stades T1-T2) et K du col où l’hyperexpression de COX2 est associée à une diminution de la réponse à la RT et à un moins bon pronostic. Milas Eur J Cancer 1995; 31A: 1580-85, Davis Cancer Res 2004; 64:279-85, Kishi Cancer Res 2000; 60: 1326-31, Nix Ann Oncol 2004; 15: 797-801, Kim Int J Radiat Oncol Biol Phys 2004; 60: 822-9

Réponse à la RT: grade histo Cyclo-oxygénase 2 49 pts, T3-T4, RCT pré-op, expression COX-2 (IHC) biopsie pré-tt Intensité et étendue du marquage: 4 groupes, COX-2+ = forte exp° Réponse à la RT: grade histo P=0,026 TRG: tumor regression grade Hyperexpression de COX-2 prédictive de non réponse à la RCT Anti-COX-2: radiosensibilisants? pts RT sensibles (TRG1-2): 24% COX-2+ pts RT résistants (TRG 4): 67% COX-2+ Smith Int J Radiat Oncol Biol Phys 2006; 64: 466-72

Profil d’expression génique (puces à ADN ou microarray) 30 pts, RCT pré-op, réponse clinique (T) et histo (grade) 23: puce à ADNc (~ 10 000 gènes) puis 7: puce à oligo (~ 22 000 gènes) 54 gènes ≠ exprimés entre répondeurs et non répondeurs (p < 0,01) Profil d’expression génique prédictif de la réponse à la RCT - Sensibilité 78% - Spécificité 86% Ghadimi J Clin Oncol 2005; 23:1826-38

Autres facteurs prédictifs? Prolifération cellulaire (Ki 67)  Index prolifératif élevé prédictif de bonne réponse? Réparation de l’ADN système MMR (mismatch repair) non prédictif de réponse Ku70 (rôle dans réparation des cassures double brin): hyperexpression associée à  réponse RT in vitro VEGF Hyperexpression de VEGF prédictive de non réponse au ttt Kim Ann Surg Oncol 2001, Qiu Dis Colon Rectum 2000, Rau J Clin Oncol 03, Charara Anticancer Res 2004, Iraimoudi Mol Cancer Ther 2005, Zlobec Cancer 2005, Zlobec Clin Cancer Res 2005

En résumé Apoptose - p53 + - p21 ++ - Bax et Bcl 2  - index apoptotique ++ EGFR + COX-2 ++ Profil d’expression génique + Autres: index de prolifération, VEGF…