Méthodes physico-chimiques d’étude des molécules biologiques L2 BBTE groupes BO/BB 144EN006 Méthodes physico-chimiques d’étude des molécules biologiques 1- Méthodes de fractionnement 2- Méthodes de caractérisation Pamela Pasetto pamela.pasetto@univ-lemans.fr laboratoire IMMM, 4ème étage bâtiment Chimie, bureau 173

Définition chromatographie 1906: expérience Tswett signe naissance chromatographie Chromatographie: ensemble de techniques pour la séparations de mixtures de substances basée sur la distributions entre deux phases: phase stationnaire solide liquide sur support inerte situé dans une colonne disposée sur un plan phase mobile gaz liquide Chromatographie sur papier Chromatographie sur couche mince

Principe de la séparation L’analyte se partage entre la phase stationnaire et la phase mobile selon un équilibre réglé par la constante K K = CS/CM= coefficient de distribution ou de partage CS = concentration analyte dans la phase stationnaire CM = concentration analyte dans la phase mobile

Chromatographie sur colonne: 1) colonne remplie, en verre ou acier éluant: phase mobile substances à séparer collection de petits volumes d’éluant Utilisation: séparation mélanges purification substances Chromatographie sur colonne: 1) colonne remplie, en verre ou acier colonne remplie d’une poudre: phase stationnaire coton ou laine de verre

Chromatographie sur colonne: 2) colonne capillaire

Schéma de principe d’un chromatographe Générateur de phase mobile injecteur colonne détecteur acquisition le résultat d’une analyse chromatographique est un chromatogramme

séparation des produits (grâce à la  affinité des analytes Principe de la séparation Mélange de produits séparation des produits (grâce à la  affinité des analytes par les phases stationnaire et mobile)

Chromatogramme tR = temps de rétention = intervalle de temps employé par un composé pour sortir de la colonne tM = temps mort = temps de rétention d’un composé pas retenu (standard interne) temps A tRA tRB B h W1/2 WB Intensité du signal chaque pic correspond à un produit pur si la séparation a été correctement réalisée, donc tRA ≠ tRB

Définitions V0 = volume mort = volume d’éluant dans la colonne (ou mieux entre l’injecteur et le détecteur) VR = volume de rétention = volume d’éluant nécessaire pour la sortie d’un composé de la colonne K = CS/CM= coefficient de distribution ou de partage k’ = facteur de capacité = nS/nM = CsVs / CMVM = K VS/VM rapport des quantités de soluté entre la phase stationnaire et la mobile α (alfa) = KB/KA = sélectivité = capacité d’un système chromatographique à séparer deux analytes (KB>KA) N = nombre de plats théoriques, efficacité d’une colonne (obtention pics fins) N = L/H = longueur colonne/ hauteur d’un plat théorique

Résolution ΔZ A B h wA Rs > 1.5 OK tRA tRB temps A tRA tRB B h W1/2 WB ΔZ wA Rs donne la mesure quantitative de la capacité d’une colonne à séparer deux analytes RS = 2 ΔZ (WA + WB)/2 (tRB-tRA) = WA + WB Rs < 1.5 Rs > 1.5 OK

Analyse quantitative en chromatographie Quand l’objectif est de quantifier un composant d’un mélange 2 conditions sont requises: 1) séparation des analytes dans la colonne 2) proportionnalité signal/quantité d’analyte (détecteur) temps tR Dosages basés sur: Hauteur pic (h) Aire pic (A) h A

Chromatographie en phase gazeuse= gaz est phase mobile (CPG) Chromatographie gaz - solide Phase stationnaire: adsorbant solide Chromatographie gaz - liquide Phase stationnaire: liquide fixé sur un support solide inerte

La chromatographie en phase gazeuse (CPG) Méthode de séparation de composés susceptibles d’être vaporisés par chauffage (sans décomposition) La séparation se fait dans une colonne soit par partage soit par adsorption Elle permet: La microanalyse (du pg au mg) La séparation de mélanges complexes (stéroïdes, acides gras, …) Une analyse qualitative et quantitative aisée Phase mobile: gaz vecteur Phase stationnaire: solide adsorbant Séparation des constituants d’un mélange: on définit un temps de rétention tR

La séparation des substances a lieu grâce à la différente affinité d’un soluté pour la phase stationnaire (adhésion / liaison chimique / adsorption physique)

La chromatographie en phase gazeuse (CPG)

Caractéristiques système Phase mobile = gaz vecteur ou porteur: hélium, azote, H2, argon, CO2 Colonne: 1) remplie 2) tubulaire ouverte=capillaire (longueur 10-100 m) Longueur: 30 cm/2-3 m Diamètre interne 2-4 mm acier inoxydable, verre, silice fondue, téflon

Chromatogramme (CPG) Injecteur Colonne Détecteur

Exemple application industrie alimentaire: chromatogramme résultant de l’analyse des arômes contenus dans une barre chocolatée Colonne CPG: PTE-5; 30m x 0,25mm ID;  0,25µm film Four: 60°C (1 min) jusqu’à 230°C à 10°C/min phase mobile: helium, 35cm/sec Det.: FID, 250°C Inj.: splitless (split fermé 3 min), 250°C

Application gaz chromatographie dans les laboratoires de médicine-légale: Analyse fluides corporels pour détecter présence substances illégales Analyse fibres et sang de la « crime scene » Détection résidus explosives Doping Conclusion = gaz chromatographe est un outil précieux car il permets de détecter de traces = haute sensibilité, une petite quantité de substance est nécessaire pour avoir un signal