Cytotoxicité : méthodes d’évaluation UNIVERSITE Dr Tahar Moulay- Saida Faculté des Sciences Département de Biologie Cytotoxicité : méthodes d’évaluation Pr.SLIMANI.M Pr SLIMANI.M

Mode d’action des toxiques 1- TOXICITE DIRECTE : Ce sont des produits doués d'une grande réactivité chimique. Ils agissent directement sur les organes cibles sans qu'aucune transformation . C'est le cas d'agents alkylants très réactifs ( sulfate de méthyle, diazométhane, formaldéhyde) produits alkylants sont capables d'introduire sur une molécule donnée un groupement hydrocarboné de type alkyle. Au niveau cellulaire, les agents alkylants attaquent les protéines et les acides nucléiques, ce qui transforme ces constituants cellulaires en dérivés substitués qui sont modifiés et ne peuvent plus assurer normalement leurs fonctions. 2- TOXICITÉ INDIRECTE La substance n’est pas toxique tel quel mais nécessite une métabolisation enzymatique préalable dans l'organisme pour qu’un effet toxique se manifeste (foie) Des mécanismes enzymatiques de métabolisation existent également dans d'autres organes (reins, cerveau, placenta, poumons, peau, cavité nasale...). Ceci explique la toxicité sélective de certains composés. Leur interaction avec les protéines amènera à une nécrose plus ou moins réparable, à des atteintes immunitaires . tandis que l'interaction avec les acides nucléiques (ADN) pourra déclencher l'apparition d'une mutation suivie éventuellement d'un processus tumoral. Pr SLIMANI.M

3-Cible biologique des substances toxiques . -La quasi-totalité des substances toxiques sont électrophiles ou le deviennent après bio transformations. Les récepteurs moléculaires sont des sites nucléophiles (Radicaux contenant des hétéros atomes OH, SH, NH-) portés par des biomolécules ADN, ARN, protéines. -Les macromolécules biologiques (ADN, ARN, protéines) sont riches en sites nuléophiles et sont des récepteurs de choix pour des toxiques électrophiles. Les lipides insaturés sont également des sites d’attaque privilégiés des agents toxiques. Les sites nucléophiles des protéines sont représentés par quelques acides aminés riches en électrons ; histidine , cystèine, lysine , tyrosine , tryptophane , méthionine, ces acides aminés réagissent avec les cancérogènes. Les acides nucléiques, la nature des substituants , des bases de ces acides nucléiques : les hydrocarbures attaquent le groupe aminé de la guanine. Pr SLIMANI.M

Toxicité cellulaire : 1-Action caustique : Le terme caustique s’applique à toute substance susceptible du fait de son pH ou de son pouvoir oxydant d'induire des lésions tissulaires. Les produits caustiques peuvent être des acides (acide ( pH< 2), des bases(pH > à 13) ou des oxydants. Les acides concentrés à pH< 2 (acide chlorhydrique, sulfurique, nitrique) , induisent ,par l’action des ions H+ , une dénaturation protéique responsable d’une nécrose par coagulation des tissus superficiels de l’épithélium de la paroi digestive. -les bases fortes à pH > à 13 ( soude, potasse, ammoniac) dissolvent les protéines et le collagène , saponifient les lipides. Elles provoquent une nécrose et une pénétration lente en profondeur. Le risque hémorragique est important. Leur viscosité favorise les lésions oesophagiennes. -Les oxydants (eau de javel) l’action des oxydants puissants : peroxyde , sels très oxygénés (MnO4) provoquent des réactions exothermiques (oxydation , chlorination) responsables de brulures thermiques et une dénaturation protéique avec transformation des acides aminés en aldéhydes. Des lésions sévères s’observent notamment sur l’estomac . Pr SLIMANI.M

-2-détruite par un toxique qui inhibe le fonctionnement de certaines structures (mitochondries) apportant de l’énergie chimiques aux organites : 2-1 -inhibition de l’apport énergétique, blocage d’un élément de la chaîne de dégradation des glucides, du carrefour pyruvique, du cycle de Krebs, de la chaîne de transfert de H+ à l’oxygène, -inhibition du couplage oxydo-phosphorylant de la chaîne d’apport énergétique au mécanisme des phosphorylations et de la production des nucléotides utilisables comme donneurs d’énergie(ATP) ( exemple DNP). 2-2-l’élévation de la concentration cytosolique en Ca2+ : Certaines toxines provoquent une augmentation de la concentration cytosolique du calcium. Cette augmentation des concentrations intracellulaires de calcium ionisé entraîne une augmentation non spécifique de la perméabilité membranaire et une entraîne l'activation de nombreuses enzymes de dégradation, comme des endonucléases capables de dégrader l'ADN, des protéases capables de dégrader les protéines intracellulaires et certaines phospholipases capables de dégrader les lipides des membranes cellulaires. Pr SLIMANI.M

-un arrêt de la plupart des fonctions cellulaires essentielles, 3- la déplétion en ATP et/ou la diminution du rapport ATP/ADP : à l’origine des atteintes mitochondriales directes ou indirectes et entraînent : -des troubles concernant toutes les activités cellulaires nécessitant de l’énergie, et notamment l'ensemble des réactions biochimiques couplées à une hydrolyse de l'ATP en ADP + Pi, réactions qui s'inscrivent fréquemment dans le cadre de l'anabolisme, -un arrêt de la plupart des fonctions cellulaires essentielles, -une élévation du Ca2+i par inhibition des ATPases contrôlant l’homéostasie calcique. Lésions mitochondriales irréversibles : pouvant être induites par une augmentation du calcium, un stress oxydatif, par une destruction des phospholipides, elles sont une clé de la mort cellulaire. -perturbation des échanges ioniques entre le milieu intracellulaire et l’extérieur de la cellule  Pr SLIMANI.M

l’une des fonctions endocellulaires nécessaires a la survie -4-détruite par un toxique qui inhibe ou altère une structure indispensable à l’une des fonctions endocellulaires nécessaires a la survie -DNA et mécanismes de synthèse des protéines , de production cellulaire -membrane cellulaire : altérations de la perméabilité ,perforation -biomédiateurs sous membranaire : fonctionnement déréglé -lysosomes-estérases , lyse locale -sites à ferritine ( formation de radicaux OH−) avec lyse locale le fer est apporté dans l’organisme et transféré vers les hèmes par l’intermédiaire de transporteurs : les ferritines,protéines dont les plus importantes se trouvent dans le foie et la rate). Pr SLIMANI.M

Peroxydation lipidique Oxydation ADN 5-Le stress oxydatif Les radicaux libres sont produits en permanence par l'organisme, à partir d'oxygène dans la cellule, notamment au niveau de la mitochondrie, dans la chaîne respiratoire. Ces substances issues de l’oxygène sont générées sous l’effet d’oxydants ( le tabac, les médicaments chimiothérapeutiques , les rayonnements ionisants, Le tabagisme, la pollution etc) peuvent induire des modifications de la structure de la macromolécule qui peuvent avoir des conséquences biologiques importantes . Le stress oxydant est observé lorsque la production des espèces oxygénées réactives (ERO) dépasse les capacités de défense des tissus. Il entraîne des altérations des composants cellulaires par réactions chimiques des espèces oxygénées réactives avec les lipides, les protéines et les acides nucléiques cellulaires Les radicaux libres sont des espèces chimiques qui possèdent un électron non apparié, ce qui les rend apte à réagir avec diverses molécules et engendre ainsi des dommages cellulaires importants comme c’est le cas pour le radical hydroxyle. H2O e- +2H+ e- e- +H e- +H+ O2 O2.- anion superoxyde H2O2 peroxyde d’hydrogène OH. radical hydroxyl H2O Oxydation Protéines Peroxydation lipidique Oxydation ADN Pr SLIMANI.M

Peroxydation lipidique Les premières cibles des EOA sont les lipides, notamment ceux présents dans les membranes cellulaires et subcellulaires. Les membranes riches en acides gras polyinsaturés (AGPI) sont très sensibles à l'oxydation en raison de leur degré élevé d'insaturation. Les radicaux hydroxyles, sont susceptibles d’interagir au niveau des doubles liaisons C=C avec les chaînes d’acides gras polyinsaturés qui constituent le double feuillet phospholipidique des membranes .ils entrainent la peroxydation des acides gras polyinsaturés provoquant une désorganisation membranaire (perturbation des propriétés physicochimiques des membranes, des communications intercellulaires et du fonctionnement des enzymes membranaires) . Les hydroperoxydes lipidiques ((ROOH) formés sont dégradés principalement en malonedialdéhyde (MDA) et 4- hydroxynonénal (4-HNE) qui réagissent de manière covalente avec les protéines et les inactivent) . Le produit de la péroxydation , le malonedialdéhyde (MDA) qui altère la fluidité et la fonction des membranes, dont la composition en acides gras insaturés module l’oxydabilité , est détecté par l’acide thiobarbiturique (formation de thiobarbituric acid reactants ou TBARS) . Pr SLIMANI.M

Oxydation des protéines Les acides aminés les plus réactifs vis-à-vis des EOA sont l’histidine, la proline, le tryptophane, la cystéine et la tyrosine. L’oxydation de ces acides aminés, entraînent des modifications structurales des protéines, facilitant de ce fait leur agrégation ou leur digestion par les protéases. Toute attaque radicalaire d’un acide aminé provoquera l’oxydation de certains résidus avec, pour conséquences, l’apparition de groupements carbonylés, des clivages de chaînes peptidiques et des ponts bi-tyrosine intra- et inter-chaînes. - Les carbonyles sont utilisés comme un marqueur de l’oxydation des protéines et de façon générale comme un marqueur du stress oxydant. La plus utilisée est celle qui met en œuvre la réaction entre les produits carbonylés et la 2-4-dinitrophénylhydrazine(DNPH) conduisant à la formation de 2-4-dinitrophénylhydrazones. Celles-ci peuvent être mesurées par spectrophotométrie . Protéine oxydée non fonctionnelle Protéine active Oxydation Pr SLIMANI.M

Les altérations de l’ADN : Les principales classes de dommages d’ADN causées par les EOA : -les coupures simples (1 seul brin est cassé au niveau de la liaison désoxyribose-base ou désoxyribose-phosphate) et doubles brins : résultant essentiellement d’une déshydrogénation du désoxyribose, -Les modifications des bases azotées en particulier la guanine, cela entraine un non-appariement des bases (guanine modifiée par la 8 OH-2’-deoxyguanosine, 8-OHdG qui est un marqueur des dommages oxydatifs de l’ADN). les pontages ADN-ADN (inter-brin et intra-brin) et ADN-protéines et les sites abasiques (site AP :site apurinique/apyrimidique)est un emplacement de l'ADN où la base (purine ou pyrimidine) est due à la rupture de la liaison N-glycosidique entre le désoxyribose et la base azotée , conduit au relargage de la base et par conséquent à l’apparition d’un site apurinique /apyrimidique non codant ( site abasique), est hautement cytotoxique et mutagène. Marqueur de l’oxydation de l’ADN ( 8 OH-2’-deoxyguanosine : Les EOA peuvent réagir avec la guanine, base constitutive de l’ADN, pour la transformer en 8-hydroxy–2’ déoxyguanosine(8-OH2DG) qui, au lieu de s’apparier avec la cytosine, s’associera avec l’adénine, entraînant des mutations au sein de l’ADN et conduisant à des altérations du message . Pr SLIMANI.M

Les systèmes de défenses anti-oxydantes 1- Les principaux systèmes enzymatique qui existent à l’état endogène, défendent les cellules contre les radicaux libres -Les superoxyde dismutases (SOD) : Les superoxyde dismutases sont capables d’éliminer l’anion superoxyde en produisant une molécule d’oxygène et une molécule de peroxyde d’hydrogène.Le peroxyde d’hydrogène formé est pris en charge par les catalases (présentes en particulier dans les hématies et les peroxysomes hépatiques) et les glutathion peroxydases à sélénium. O2 -. + O2-. + 2H + H2O2 + O2 -La catalase est également responsable de l'élimination d' H2O2 par une transformation en H2O et O2 2 H2O2 → 2 H2O + O2 -Les glutathion peroxydases (Gpx) : Toutes les glutathion peroxydases contiennent dans leurs sous-unités un à quatre atomes de sélénium selon l’isoenzyme , dégradation des peroxydes organiques et du peroxyde d’hydrogène 2GSH (réduit) + H2O2 GSSG + 2H2O 2GSH + R-OOH GSSG + H2O + R-OH Peroxydase GSH : glutathion réduit GSSG : glutathion disulfide (S-S) (qui à son tour sera réduite par l'intermédiaire de la glutathion réductase ) . Pr SLIMANI.M

-les métallothionéines (MT) 2-Les protéines chélatrices du fer comme la transferrine et l’hémosidérine ou du cuivre comme la céruloplasmine . 3-Les molécules antioxydantes ou piégeurs de radicaux libres : la vitamine E connue pour son activité antiradicalaire très puissante ; la vitamine C, les caroténoïdes, l’acide urique, le glutathion et les thiols, les métallothionéine. -les métallothionéines (MT) Les MT sont des protéines de faibles masses moléculaires (6 kDa), riches en cystéines , ce qui leur permet de complexer les cations métalliques par les groupements thiols .Les métallothionéines diminuent ainsi la disponibilité des métaux lourds dans la cellule ce qui réduit sa toxicité. Pr SLIMANI.M

METHODES D’ETUDES DE LA CYTOTOXICITE Plusieurs méthodes d’étude de la cytotoxicité : les méthodes fondées sur des perturbations de la perméabilité membranaire et les méthodes fondées sur des altérations de la prolifération cellulaire. Son but est de déterminer la concentration inhibitrice 50% (IC50) qui est la concentration qui inhibe de moitié la prolifération cellulaire globale. Détermination de la viabilité cellulaire : -Une série de tests colorimétriques dont le principe repose sur la réduction de réactifs colorés , des sels de tétrazolium , par les déshydrogénases des cellules viables .Ces sels solubles vont être réduits lors de la réaction enzymatique pour donner du formazan. Ces tests à base de sels de tétrazolium sont présentés comme révélateur de l’activité mitochondriale car ils sont réduits par les succinates réductases du complexe II de la chaîne respiratoire mitochondriale. Il existe 3 types de colorants : -les colorants vitaux ou d’exclusion (cellules mortes) - les colorants supravitaux ou d’inclusion (cellules vivantes) -les colorants nécessitant une étape de métabolisation ( mesure des capacités métaboliques

1 Test MTS Le test MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) est une méthode de dosage par colorimétrie utilisée pour évaluer la viabilité cellulaire grâce à l'activité déshydrogénase des mitochondries des cellules vivantes. Le réactif MTS de couleur jaune pâle peut traverser la membrane cellulaire. Dans la cellule, ce dernier est réduit par la succinate déshydrogénase des cellules vivantes actives en formazan. Ainsi, la quantité de formazan produite est proportionnelle au nombre de cellules viables. Le formazan, de couleur jaune foncé, est un composé soluble dans le milieu de culture cellulaire. La production de ce produit est suivie en mesurant l’absorbance par spectrophotométrie à 690 nm . La cytotoxicité a été calculée comme suit: Cytotoxicité (%) = [(DO des cellules contrôles - DO des cellules exposées aux toxiques ) / (DO des cellules de contrôle)] x 100

Test au MTT Le test du MTT (3-[4,5-diméthylthiazol-2yl]-2,5-diphényltétrazolium bromide), est un indicateur de l'intégrité et de l'activité mitochondriales assimilables à une mesure de la vitalité cellulaire . Est un colorant de type tétrazolium (jaune) qui est réduit par les enzymes mitochondriales (succinate déshydrogénase ) en un composé coloré en bleu . En présence du substrat, les sels de tétrazolium du substrat sont transformés en cristaux insolubles de formazan grâce à l'activité de la succinate déshydrogénase. La quantité de sel formazan produite par les cellules à partir du MTT est mesurée par spectrophotométrie à 540 nm. L’intensité de la couleur est directement proportionnelle au degré d’intégrité des mitochondries. Il s’agit d’un test utile pour détecter des composés cytotoxiques en général ainsi que les agents ayant les mitochondries pour cible spécifique.

Principe du test MTT MTT MTT formazen Succinate déshydrogénase

Test de PrestoBlue (Resazurin): La résazurine est principalement utilisée comme un indicateur d'oxydo-réduction dans des analyses de viabilité cellulaire. Elle est utilisée pour évaluer l 'activité métabolique des mitochondries . Ce test utilise le pouvoir réducteur des cellules vivantes actives pour transformer le réactif résazurine (7-hydroxy-3H-phénoxazin-3-one 10-oxyde), forme oxydée de couleur bleu , perméable aux cellules et pratiquement non-fluorescent, en résorufine, forme réduite de couleur rouge fortement fluorescent.. Ce test colorimétrique est basé sur la réduction de la résazurine par des enzymes mitochondriales , mesurée à une longueur d’onde 570 nm.

ROUGE NEUTRE (Neutral Red) Le neutre rouge (NR) ou chlorure de 2-amino-3-méthyl-7-diméthyl amino phénazonium est un colorant vital hydrosoluble , utilisé dans certains tests de cytotoxicité. l’entrée du colorant et son relargage sont fonction de la perméabilité cellulaire : - le rouge neutre permet de différencier les cellules vivantes des cellules mortes. il permet l’étude de l’action des xénobiotiques sur l’arrangement des phospholipides des membranes et sur la perturbation des fonctions associées (récepteurs hormonaux, enzymes, perméases, canaux ). -Après sa diffusion à travers la membrane plasmique de cellules intactes, Le NR étant légèrement électropositif, il a tendance à former des liaisons électrostatiques avec les sites anioniques présents dans l’environnement lysosomal. -Le colorant est exclu des cellules mortes. Après le temps de contact avec les xénobiotiques, l’évaluation du taux d’incorporation du RN par les cellules viables se fait après fixation des cellules au formaldéhyde , puis extraction du RN avec un mélange acide acétique éthanol et quantification par spectrophotomètre à 540 nm.

La viabilité cellulaire est calculée comme suit: .le bleu trypan : (bleu diamine) est un colorant vital hydrophile utilisé couramment en culture cellulaire pour différencier les cellules mortes des cellules vivantes.. La coloration au bleu de trypan est une méthode de coloration des cellules mortes. -est un colorant anionique du groupe des colorants azoïques ,un réactif chromophore de couleur bleu chargé négativement qui a tendance à pénétrer dans les cellules. Une fois dans la cellule, la molécule va être rejetée dans le milieu extérieur. Ce mécanisme d’exclusion nécessitant de l’énergie. soit de l’ATP. Ainsi, seulement les cellules vivantes expulseront la molécule et resteront incolores au microscope. Contrairement à cela, une cellule morte deviendra bleue. La viabilité cellulaire est calculée comme suit: % Viabilité cellulaire = [(cellules totales) – (cellules colorées en bleu) / cellules totales] x 100 Cette méthode est couramment utilisée lors de numération cellulaire. La détermination du taux de mortalité se fait par comptage cellulaire en cellule de Malassez.

Iodure de prodium , est un fluorochrome non perméant qui ne diffuse qu’au travers des membranes plasmiques perméabilisées et il ne colore que les acides nucléiques des cellules mortes ayant perdu leur intégrité membranaire , ou ils s’intercale de manière non spécifique toutes les 4 à 5 paires de base d’ADN .Seules les cellules mortes présentent donc une fluorescence rouge de leur noyau détectable soit par microscopie de fluorescence , soit par cytométrie en flux. -Le test de la lactate déshydrogénase LDH , qui est une enzyme cytosolique particulièrement stable qui catalyse la conversion du lactate en pyruvate avec production de NADH. Ce test est utilisé pour détecter les effets directs sur la membrane plasmique . -la présence de LDH dans le surnageant cellulaire indique des lésions au niveau de la membrane plasmique. Les cellules mortes suite à la destruction de leur membrane plasmique, libèrent une grande quantité de LDH. Le dosage de cette enzyme peut se faire de diverses façons. Il est possible de le réaliser par des mesures d’absorbance à l’aide d’un lecteur de microplaques. Pr SLIMANI.M

La LDH oxyde le lactate en pyruvate, ce qui a pour effet de réduire le NAD+ en NADH/H+ qui se régénère en réduisant un sel de tétrazolium jaune en composé formazan rouge, détecté par mesure spectrophotométrique à 490 nm

Etude de la perméabilisation des membranes mitochondriales : Mesure de la chute du potentiel transmembranaire (ΔΨm) Un des paramètres biochimiques de l’évaluation de la mort cellulaire est la perméabilisation des membranes mitochondriales qui peut être mis en évidence par la chute du potentiel transmembranaire mitochondrial et qui est quantifiée par fluorimétrie ou cytométrie en flux grâce à des fluorochromes sensibles au potentiel transmembranaire mitochondrial (la sonde ratiométrique IC-1 ). -La chute du potentiel transmembranaire provoquée par ouverture des pores de transition de la perméabilité (Mitochondrial Permeability Transition pores :MTP) de la membrane interne de la mitochondrie. Il en résulte une augmentation de la perméabilité aux molécules de PM inférieur ou égal à 1500Da, alors que dans les conditions normales la membrane interne de la mitochondrie est pratiquement imperméable aux petites protéines ce qui crée un gradient électrochimique. Les MTP jouent un rôle déterminant dans l'induction de l'apoptose par les radicaux libres de l'oxygène(RLO). Ainsi, sous l'effet de stress oxydants, les mitochondries subissent une transition de perméabilité avec libération de Ca++, et sont le siège d'un gonflement important et d'un découplage de la respiration mitochondriale.

Méthodes de cytotoxicité basées sur l ’altération de la prolifération cellulaire Le paramètre le plus important pour analyser la prolifération cellulaire est la mesure de la synthèse d’ADN comme marqueur spécifique de la réplication de l’ADN .Des précurseurs marqués de l’ADN sont utilisés :3H-thymidine , la 5 bromo 2’ désoxyuridine(BrdU) ou la 5 éthyl 2’desoxyuridine (EdU), lors de la synthèse d’ADN, ces précurseurs sont incorporés à la place de la thymidine. La bromodésoxyuridine (BrdU ) , est un nucléoside synthétique, analogue structurel de la thymidine, où le groupe méthyle en 5 est remplacé par un atome de brome. L’incorporation de la BrdU (5-bromo-2’-désoxyUridine) lors de la phase de réplication de l’ADN est un reflet de l’activité mitotique et renseigne sur la prolifération cellulaire. La détection du BrdU nécessite l’utilisation d’un anticorps anti –BrdU , et donc une étape préalable de dénaturation de l’ADN , pour permettre à l’anticorps d’interagir avec le BrdU. Ajout Iodure de Propidium pour l’analyse du cycle

GENOTOXICITE : Test des comètes : Cette technique permet de mesurer les cassures induites directement par un agent génotoxique et indirectement lors des processus enzymatiques de réparation des dommages ou lors de processus secondaires de fragmentation de l'ADN tel que l'apoptose. Les cellules incluses dans une couche de gel d' agarose déposée sur une lame de microscopie et lysées. Ainsi sous l'influence du champ électrique , l'ADN va migrer. Après coloration à l'acridine orange, les fragments d'ADN sont observés au microscope à fluorescence. Cette technique permis de détecter des lésions de l'ADN sous l'effet de l’agent toxique. Les cellules dont l'ADN est intact se présentent alors sous la forme d'une sphère avec des contours bien marqués. Inversement, si l'ADN est endommagé, les fragments vont migrer à côté du noyau et former une traînée, assimilable à la queue d'une comète : TEST DES COMETES (Ostling and Johanson, 1984). En 1988, Singh modifie la technique en pratiquant l'électrophorèse en milieu alcalin, à pH > 13. Dans de telles conditions, le test permet de détecter les cassures simple-brin et les sites alcali-labiles, Il donne à cette variante du test des comètes le nom de « Single cell gel electrophoresis» ,SCGE (Singh et al, 1988).

Tête queue Tête queue Noyau non endommagé Noyau peu endommagé Noyau très endommagé ( cellule normale ) ( très nombreux fragments ) Représentation schématique des comètes

Méthodes d’ estimation des quantités d’ADN Méthode basée sur la fluorescence La fluorescence est une forme de luminescence se produisant suite à l’absorption de photons par une molécule de type fluorophore, fluorochrome ou sonde fluorescentes. Fluorochrome qui se fixe sur le DNA et dont le taux de fixation est directement lié a la quantité de DNA , émettra une quantité de fluorescence qui sera proportionnelle a la quantité de DNA présente. Les différents fluorochromes utilisés : 1) -Le Hoechst 33342 et le DAPI qui se fixent préférentiellement sur des séquences de l’ADN riche en paires de bases A-T. - Les colorants Hoechst sont des marqueurs fluorescents de la famille des benzimidazole qui se lie à l’ADN . Le Hoechst 33342 , possède une structure plus lipophile et traverse plus facilement la membrane lipidique des cellules pour atteindre l’ADN se lie préférentiellement aux bases A-T et émet une fluorescence bleue quand il est excité dans l’UV. -DAPI ( diamidino-4 ,6 phénylindol-2dichlorohydrate) est une molécule fluorescente ,appartient au groupe des colorants indols , se lie préférentiellement avec les bases A-T et se loge dans le petit sillon de l’hélice d’ADN. le DAPI absorbe la lumière UV (350 nm), il émet une fluorescence bleue brillante (450-490 nm) , ce qui permet de détecter et quantifier l'ADN grâce à un microscope à fluorescence ou par cytométrie en flux.

2) La mithramycine, la chromomycine: ces antibiotiques ont la capacité de se complexer avec l’ADN et de devenir fluorescents .Ces molécules se fixent dans des régions riches en paires de bases G-C  par des mécanismes non intercalants. Il est nécessaire de fixer les cellules avec de l’éthanol ou un aldéhyde pour que ces molécules puissent se fixer sur leur cible. La présence de Mg2+ dans le tampon de marquage est nécessaire pour que ces molécules se complexent à l’ADN. Le maximum d’absorption pour ces deux molécules , lorsqu’elles sont complètement fixées à l’ADN est de 440nm (orange). 3)- Intercalants: Iodure de propidium, Bromure d'ethidium et Acridine orange -Le iodure de propidium (PI) et le bromure d'éthidium (EB), appartenant à la famille des phénathridines et se lient à l’ ADN grâce à leurs charges positives. Sont des agents intercalants des doubles brins d'ADN (sans spécificité de base),Ils ne peuvent pas traverser la membrane cytoplasmique intacte et pénètrent dans les cellules dont la membrane est endommagée : ils sont donc utilisés comme marqueurs de cellules mortes (nécrotiques), marqueurs de l'intégrité membranaire. -L’acridine orange ,se fixe différemment sur les acides nucléiques mono et bicaténaires .Sur les acides nucléiques monocaténaires , elle peut se polymériser et émettre une fluorescence rouge sombre. Par contre , elle se fixe à l’état de monomère sur l’ADN bicaténaire , émettant alors une fluorescence verte intense sous illumination ultraviolette.

3 Autres méthodes de cytotoxicité 3-1la quantification du calcium cytosolique qui apporte des éléments d’information sur les mécanismes précoces d’apparition de la cytotoxicité. La spectrofluorimétrie permet de mesurer, sur une population de cellules, la [Ca2+]i grâce à une sonde fluorescente sensible au calcium une sonde fluorescente sensible au calcium (sonde Indo-1). Cette sonde est utilisée sous la forme de son ester acétoxy-méthylique (Indo-1 AM), dont la partie ester lui permet de franchir facilement la double couche phopsholipide membranaire .Une fois dans le cytoplasme les estérases présentes déestérifient la sonde qui est alors piégée dans la cellule . La forme acide ainsi libérée se lie aux ions calcium. La sonde Indo-1, excitée à 350 nm, présente deux émissions à 405 et à 480 nm, qui correspondent respectivement à la forme liée et à la forme libre. La proportion de sonde sous forme liée et sous forme libre est fonction de la concentration de calcium cytoplasmique et l’intensité de fluorescence croit lorsque la concentration en calcium augmente. La concentration intracellulaire en calcium libre peut être estimée en valeurs arbitraires à partir du rapport entre les mesures de fluorescence à405 et 480 nm.

organites intracellulaires. Charge d'une cellule en sonde /AM. Le dérivé acétoxyméthylé (sonde AM) de la sonde, lipophile, qui pénètre dans les cellules est hydrolysé par les estérases intracellulaires en sonde hydrosoluble qui se trouve piégée dans la cellule.

3-2Mesure du glutathion réduit : marqueur de stress oxydatif . Le glutathion, un tripeptide (γ-glutamyl-cysteinyl-glycine), joue un important dans la détoxification des xénobiotiques potentiellement toxiques. Le glutathion réduit (GSH) peut s’oxyder en glutathion disulfide (GSSG) en présence de radicaux libres, ce qui permet la neutralisation de ces radicaux et donc de prévenir un stress oxydant. La détermination du ratio des deux formes (GSH et GSSG) constitue un paramètre important dans la caractérisation du statut oxydatif cellulaire. Le groupe sulfhydryle du glutathion réagit avec le DTNB (acide 5,5'-dithio-bis-2- (acide nitrobenzoïque) et produit le 5-thio-2-nitrobenzoïque qui est de couleur jaune (TNB). Le disulfure mixte, GSTNB (entre le GSH et TNB), produit de manière constante, est recyclé par la glutathion réductase à recycler pour donner du GSH. Au cours de ce recyclage, il y a production de plus de TNB. La mesure de l'absorbance à 405 nm du TNB fournit une estimation précise du GSH totaux dans l'échantillon .

3-3Test au dihydrodichlorofluorescéine-diacétate (DCFH-DA) Le diacétate de dichlorodihydrofluorescéine 2’,7’ (H2DCFDA) , perméant aux cellules, est une forme chimiquement réduite de fluorescéine utilisée pour évaluer les radicaux libres oxygénés produits par la cellule ( neutrophiles et macrophages). La quantité de ROS produites est mesurée par technique de fluorescence en utilisant la 2’,7’- dichlorofluorescine-diacétate (DCFH-DA), une sonde non fluorescente. Après sa désacétylation (2’,7’ DCFH -DA ) par les estérases intracellulaires, ce composé est oxydé par les ROS et devient la dichlorofluorescéine (2’,7’ (DCF), caractérisée par sa fluorescente.  Mesure des ROS par fluorescence due à l’oxydation de la dichlorofluorescine (DCFH) en dichlorofluorescéine (DCF)

3-4les méthodes basées sur la détermination quantitative de la charge cellulaire globale en ATP, excellent paramètre de viabilité et de croissance cellulaire, -Le taux d’ATP peut également être analysé et donne une indication sur les capacités énergétiques de la cellule et donc sa viabilité . Les cellules non viables perdent non seulement la capacité de synthétiser l’ATP , mais contiennent également des ATPases endogènes qui dégradent rapidement l’ATP existant. Ce test est basé sur le dosage de la quantité d’ATP des cellules qui est proportionnelle au nombre des cellules vivantes. Les cellules traitées et lysées sont incubées en présence de l’enzyme luciférase et du substrat luciférine. La mono-oxydation de cette dernière par la luciférase, en présence d’ATP et d’oxygène moléculaire produit un signal lumineux proportionnel à la quantité d’ATP présentes dans les lysats cellulaires. la mesure de l’ATP repose sur le comptage de photons produit par l’action d’une enzyme, la luciférase, qui émet des photons en hydrolysant les molécules d’ATP.  ATP + d-Luciferin + O2 →Oxyluciferin + AMP + Pyrophosphate + CO2+ photons (560nm)

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