Optimisation et Validation d’Un Procédé de Dosage de Tétracycline Présentant dans Les Viandes Optimisation et Validation d’Un Procédé de Dosage de Tétracycline Présentant dans Les Viandes Réalisé par : Khallouli khouloud Balti Islem Encadrée par: Hbaieb Bouchaira Souhaira 1 Présentation de le mémoire de Projet de Fin d’Etudes Initiation á méthodologie d’enseignement et de recherche

Objectifs Optimisation des conditions optimales pour doser les tétracyclines Extraction des tétracyclines a partir des viandes Dosages des tétracyclines par HPLC et valider ces critères. 2

Problématique Quels sont les propriétés physicochimiqu es des tétracyclines ? Quelle est la méthode adéquate pour extraction des tétracyclines principalement dans les viandes ? quels sont les critères d’optimiser et valider le tétracycline? 3

plan Optimisation de la méthode utilisée Etude bibliographique Validation analytique Conclusion et perspectives Introduction 4

5 Année 50 Laboratoire Pfizer Médicine humaine Vétérinaire

Etude bibliographique 6

Un antibiotique Substance semi- synthétique obtenue par modification d’une molécule naturelle substance chimique synthétique 7 C’est quoi un antibiotique ? substance naturelle élaborée par des micro- organismes

8 Détruit la membrane bactérienne Bloque la genèse protéique Inhibe la synthèse du paroi bactérien Un antibiotique Freine la duplication de l’ ADN Mode d’action

Tétracyclines Des agents a large spectre 9 Parasites protozoaires mycoplasmes son activités contrent Une large gamme de bactérie : Gram+ gram- Tétracyclines:

10 Bloque la liaison d’amminoacyl- ARnT au site accepteur Inhibe le complesse ARNm- ribosome Empêche Synthèse des protéines Mode d’action de tétracycline

des bases faibles à cause du groupement diméthylamino Formule brute : C 22 H 24 N 2 O 8 Bonne stabilité à l’état solide, mais perte d’activité en milieu aqueux Propriétés des tétracyclines Molécules instables dans l’eau 11

12 Élimination métabolisme distribution Propriétés pharmacologiques

Une douleur abdominale Des infections à levures vaginales Diarrhée Nausée et des vomissements Les effets secondaires 13

Les effets indésirables Une grossesse Une allergie Une réduction importante de la fonction rénale 14

Les différentes structures des tétracyclines est décrite ci-dessous 15

La Chromatographie Liquide à Haute Performance 16 Utilisée en chimie analytique grâce à : Rapidité Haute résolution Simplicité

17 Appareillage d’une chaine HPLC Injecteur Pompe Ordinateur Colonne Détecteur +

Extraction 18

19 Extraction par Tampon Déprotonisation par TCA Centrifusage des extraits puis filtration par papier Purification par SPE sur cartouche C18 Etapes d’extraction des tétracyclines a partir des viandes

Comparaison avec échantillon de contrôle Elution par methanol La détection des analytes se fait par LC-MS La séparation chromatographi que se fait sur une colonne C18 l’éluat récolté est évaporé à sec et repris dans l’eau l’éluat récolté est évaporé à sec et repris dans l’eau 20

21 HPLC/MS

LC\MS Température du four à colonne : 30°C Les conditions chromatographiques LC\MS 22 Volume d’injection : 10 µl Température de l’autoinjecteur : 10°C Phase moblile : MeOH /ACN

Optimisation 23

Paramètres d’optimisation Longueur d’onde Phase mobile Le débit Température de colonne 24

25 Débit de phase stationnaire température colonne Phase mobile Optimisation

26 phase mobile Acide oxalique Méthanol Acétonitrile

27 Le temps de rétention du débit le plus faible est optimisé pour le dosage Mesure les temps de rétentions différentes valeurs du débits Choix de débit

28 Le temps de rétention du Température le plus faible est optimisé pour le dosage Mesure les temps de rétentions différentes valeurs du Température Choix de Température

Phase mobile: Acide oxalique, méthanol Acetonitrile Volume d Injection : 20 µl Débit : 1ml/mn COLONNE :Chromolith ® Performance (100 mm*4,6 mm) Diamètre des particules 2µm T: ambiante, durée d’analyse =20minutes Détection ultraviolette UV, λ = 355 nm Conditions chromatographique 29

Validation 30

31 Phase mobile Injection des solutions dans les conditions chromatographiques précitées S1 Etude de la spécificité: Solution à examiner C solvant HCL =C1

Chromatogramme de la phase mobile Chromatogramme du tétracycline Bonne séparation La méthode est spécifique 32 Chromatogramme de solvant

Une série de solutions du tétracycline 33 Etude de la linéarité: Mesure Aires=f(cº) Pour 3 jours  La droite de régression est linéaire  Coefficient de corrélation R  R moy > 0,995

34 Solution 100% Répétabilité Reproductibilité  Même jour  7 injections  3 jours  18 injections  6 injections par jours Etude de la fidélité: RépétabilitéCV<2%ReproductibilitéCV <2%

Etude de l’exactitude: 35 Recouvrement moyen = 100 % CV moyen < < 2% C(ug/mL ) % tetracycline

36 Préparation d’une gamme de concentration croissante Dilutions successives a partir de la concentration nominale Détermination des limites de détection et de quantification LD & LQ T1T1 T4T4 T3T3 T2T2 T5T5

Chromatogramme du T3 Chromatogramme du T5 Chromatogramme du T4 37

C T3 < LD < C T4 À l’aide des équations : 38 et

39 La réalisation de cette extraction et validation, exige tout de même que Tous les résultats obtenus sont conformes Conclusion

40 Perspectives y-a il d’autres méthodes pour valider le tétracycline avec absence de risque et a des résultats plus performants ?

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