-Hémoglobinopathies : Greffe de CSH allogénique vs Thérapie Génique Marina Cavazzana-Calvo, Hopital Necker Enfants Malades, Universite Paris Descartes, France No disclosure of any relationships nor interests

Epidémiologie des maladies de l’Hb (WHO, June 2008 ; Weatherall DJ, Blood 2010) Naissances avec une pathologie de l’Hb par 1000 enfants nés vivants >350,000 enfants naissent chaque année avec une forme sévère de maladie héréditaire de l’ Hémoglobine ~ 80% des enfants atteints nés dans des pays pauvres ou en voie de développement 3.4% des décès chez les enfants âgés de moins de 5 ans >9 million de porteuses enceintes chaque année 5.2% de la population mondiale porteurs d’un variant significatif 2 2

Selection of the sickle cell trait HbS mutation protects against Plasmodium falciparum infections Sickle cell mutation Falciparum malaria Eaton JW, et al., eds. Sickle cell disease: basic principles and clinical practice. New York: Raven Press Ltd. 1994. HbS = sickle cell haemoglobin. 3

50 million heterozygous HbS individuals in the world ? Africa 10–40% HbS mutation carriers in the population 200,000–300,000 SCD newborns/year USA 1 SCD newborn/600 births in Afro-American population 60,000–70,000 SCD patients France 405 SCD newborns in 2007 10,000 SCD patients de Montalembert M. Br Med J. 2008;337:a1397. 4

Severity of SCD varies widely among patients Severe forms of SCD Asymptomatic patients Intermediate forms of SCD Penicillin, folic acid, hydration Hydroxyurea Chronic blood transfusion Bone marrow transplantation Pain ACS Stroke ACS = acute chest syndrome. 5 5

Potential modifiers of disease severity Neutrophils/ inflammation Adhesion molecules Red blood cells HbF -Thalassaemia Endothelium NO/ET1 Reproduced from Stuart MJ, Nagel RL. Lancet. 2004;364:1343-60 © 2004, with permission from Elsevier. Modified by M de Montalembert. ET1 = endothelin 1. 6 6

Complications of SCD in children Polymerization of deoxy-HbS Endothelial dysfunction Age (years) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Bacteraemia Pain ACS ASS Stroke Chronic organ damage highly variable ? Castro O, et al. Blood. 1994;84:643-9. Gill FM, et al. Blood. 1995;86:776-83. Ohene-Frempong K, et al. Blood. 1998;91:288-94. ASS = acute splenic sequestration. 7 7 7 7

Causes of death in children with SCD Year (range) Country Incidence Causes Gill 1978–98 USA 1.1/100 pt-yr 11 sepsis (9 S.pn), 2 ASS, 1 CVA Thomas 1985–92 France (Paris) 0.29%/yr 15 sepsis (8 S.pn), 3 ASS, 3 CVA Quinn 1983–04 (Texas) 0.59/100 pt-yr 5 sepsis (4 S.pn), 3 ACS, 2 multi-organ failure, 1 CVA, 1 myocardial infarct Gill FM, et al. Blood. 1995;86:776-83. Thomas C, et al. Arch Pediatr. 1996;3:445-51. Quinn CT, et al. Blood. 2004;103:4023-7. CVA = cerebrovascular accident; pt-yr = patient years; S.pn = Streptococcus pneumoniae. 8

Causes of death in children with SCD Year (range) Country Incidence Causes Gill 1978–98 USA 1.1/100 pt-yr 11 sepsis (9 S.pn), 2 ASS, 1 CVA Thomas 1985–92 France (Paris) 0.29%/yr 15 sepsis (8 S.pn), 3 ASS, 3 CVA Quinn 1983–04 (Texas) 0.59/100 pt-yr 5 sepsis (4 S.pn), 3 ACS, 2 multi-organ failure, 1 CVA, 1 myocardial infarct 1983–05 USA (Texas) 0.52/100 pt-yr 5 ACS, 4 multi-organ failure, 4 S.pn sepsis Gill FM, et al. Blood. 1995;86:776-83. Thomas C, et al. Arch Pediatr. 1996;3:445-51. Quinn CT, et al. Blood. 2004;103:4023-7. Quinn CT, et al. Blood. [Epub ahead of print 2010 Mar 1]. CVA = cerebrovascular accident; pt-yr = patient years; S.pn = Streptococcus pneumoniae. 9

Earlier diagnosis positively impacts survival 100 98 96 94 92 90 88 86 10 20 30 40 10 Years Months Survival (%) HbSS diagnosed in newborn period HbSS diagnosed after newborn period HbSS = haemoglobin SS. Vichinsky E, et al. Pediatrics. 1988;81:749-55. 10

Thalassémie

-Thalassémie: résumé physiopathologique Excès de chaînes libres d’α-globine Formation d’hème et d’hémichromes Déformation Dégradation érythropoièse inefficace Anémie chronique and hémolyse Surcharge ferrique Toxicité ferrrique Hémolyse érythropoièse Inéfficace Fixation membranaire d’IgG et C3 Élimination des GR endommagés Synthèse de l’erythropoiétine augmentée Anémie Splénomégalie Oxygénation des tissus réduite Déformations squelettiques, ostéopénie Expansion de la moelle érythroïde Surcharge en fer Augmentation de l’absorption en fer Olivieri NF, et al. N Engl J Med. 1999;341:99-109.

Options Thérapeutiques -Thalassémie : Options Thérapeutiques Prise en charge médicale: chélation du fer + transfusion Greffe de CSH allogénique Thérapie génique

% Accident, Renal Failure, HIV/AIDS, Familial autoimmune disorder, Anorexia, Hemolytic Anemia, Thrombocytopenia.

Suivi du Patient Thalassémique Visita odontoiatrica Trasfusione Visita Visione esamii Visita ORL Visita Oculistica Rx torace ECG Holter Ecocardiogramma Ecoaddome MOC Ormoni Visita endocrinologica

Results of HSCT in 900 consecutive patients, aged 1-35 years, transplanted from an HLA identical sibling in Pesaro since December 1981 Haematologica 2008;93:1780-1784

Rationnel pour le traitement par thérapie génique des -hémoglobinopathies ~75% patients do not have a geno-identical donor, and those who do face increased morbidity and mortality caused by graft vs. host disease (GVHD): Gene therapy with autologous transplantation would be available to patients without compatible donor and has no risk of GVHD. Mortality MUD = 8%. Use of non-immunosuppressive conditioning regimen (Busulfex) is expected to avoid much of the morbidity and mortality of allogeneic BMT. Although there is no in-vivo selective advantage for corrected HSCs, there is correction of dyserythropoiesis and increased RBC life span: studies in mice and humans suggest that partial (~10%?) marrow chimerism can result in the correction of a sufficient fraction of RBCs. 17

Cible: la cellule souche Hématopoïétique (CSH) Sustained correction of Red Blood Cells (RBCs)

The Human b-Like Globin Gene Cluster -globin expression at therapeutic levels requires transfer of the whole -globin gene together with complex regulatory elements 80Kb 60Kb 40Kb 20Kb 0Kb DNAse 1 Hypersensitive Sites 1 2 3 4 Locus Control Region (-LCR) The Human b-Like Globin Gene Cluster (Chromosome 11) e Gg Ag yb d b Exon 3 Exon 1 Exon 2 Intron 1 Intron 2 3' Enhancer b promoter

LentiGlobin vector [marked A-T87Q-globin] with self-inactivation and chromatin insulators cHS4 insulator Chromatin Insulator RRE cPPT/FLAP HS2 HS3 HS4 2.7 Kb b-LCR 644bp 845bp 1153bp human -globin gene 3’ enhancer III I II p 266bp  HIV LTR bA-T87Q SIN deletions ppt Reverse transcription & chromosomal integration HS2 HS3 HS4 human -globin gene 3’ enhancer III p ppt RRE cPPT/FLAP 644bp 845bp 1153bp I II 266bp  cHS4 Insulator SIN + Insulator bA-T87Q 20

Correction des paramètres hématologiques chez les souris Hbbth/th transplantées Reticulocytes (%) GR (106 per mm3) Hbbth/th Hbbth/th/GFP * * Hbbth/th/bA C57BL/6 5 10 15 20 25 30 2 4 6 8 10 12 Hematocrite (%) Hemoglobine (g/dl) Hbbth/th Hbbth/th/GFP * * Hbbth/th/bA C57BL/6 10 20 30 40 50 60 2 4 6 8 10 12 14 16 18

Correction de la splénomegalie Hbbth/th Lenti-b-globin-LCR Souris contrôle normale Hbbth/th mock transplanted Hbbth/th

Schéma du protocole clinique Vecteur + Cytokines Test et Libération / congélation Augmente le % de CSH Transduites Cellules CD34+ Recueil de moelle osseuse Injection IV Cellules transduites (> 4x106 CD34+/Kg) (Spontaneous Homing) Optimise la myéloablation sans immunosuppression (2x108 unsorted BM cells/Kg kept for rescue) Conditionnement de la moelle osseuse Busulfex 23

Résumé clinique pré-transplantation du patient "PLB" Garçon alors âgé de 18 ans atteint d’une forme sévère de thalassémie E/0 sans mutation HPFH ou α. Transfusion-dépendant depuis l’âge de 3 ans (> 225 ml GR/kg/an pour une Hb > 10 g/dl). Taux spontanés d’Hb descendant jusqu’à 4.5 g/dl. Hépato-splénomegalie majeure (splénectomie à l’âge de 6 ans) et retard de croissance. Echec du traitement par Hydroxyurée (entre l’âge de 5 et 17 ans). Desferoxamine (5 jours/sem) depuis l’âge de 8 ans, et Exjade P.O. depuis l’âge de 18 ans (malgré les nausées). Pas de fibrose hépatique. Surcharge modérée en fer à l’IRM hépatique (561 mol/g). CHANGED – added study / sponsor Enfant unique. Pas de doneur apparenté génoidentique HLA-compatible. Répondant strictement aux critères d’inclusion et d’exclusion. Transplantation à l’âge de 19 ans le 07/06/2007 LentiGlobin® Gene Therapy Study 24

Conversion to transfusion independence for > 3.5 years at 8.5-9.5 g/dL Hb, > 4.5 years post-transplantation Transplantation on June 7, 2007 Last RBC transfusion on June 6, 2008 Phlebotomies (200 ml each) to remove iron Months post BMT transfusion phlebotomy phlebotomies last transfusion CHANGED – added study / sponsor – no change to data LentiGlobin® Gene Therapy Study 25

Globin chains in PLB’s blood CHANGED - added study / sponsor – inserted updated figure to M53 LentiGlobin® Gene Therapy Study 26

Gene therapy vs allogeneic bone marrow transplantation HSCT GT Acute and chronic GvHD VOD   Infections Severe organ disability Infertility No TRM in all the clinical trials Safety issues 27