Biologie Moléculaire Travailler avec l’ADN

ADN Genomique Extra-genomique Prokaryote vs. eukaryote Circulaire ou linéaire Un ou plus d’un chromosomes Extra-genomique Vecteurs Plasmides

Vecteurs Vs Plasmides Vecteur: Véhicule d’ADN permettant le clonage, le maintien et l’amplification d’une séquence d’ADN Plasmides Virus Chromosomes Tous les plasmides sont des vecteurs Pas tous les vecteurs sont des plasmides

Plasmides Petites molécules d’ADN circulaires maintenues et amplifiées chez des cellules eucaryotes ou procaryotes Amplification chez les bactéries Utilisé en tant que vecteur pour le clonage ou l’expression d’ADN d’intérêt

Caractéristiques des Vecteurs Plasmidiques Sites de restrictions uniques pour le clonage Origine de réplication (Ori) Marqueur de sélection Gènes de résistance aux antibiotiques

Isolation d’ADN Buts Isolation de l’ADN désiré Chromosomique ou plasmidique? Retirer les autres composantes ADN chromosomique ou plasmidique? Protéines ARN Produits chimiques Sels, détergents, etc.

Isolation d’ADN (suite) Lyse cellulaire Paroi et membrane Enzymatique Chimique Mécanique Isolation de l’ADN désiré Sédimentation différentielle Chromatographie Retirer les autres composantes

Isolation d’ADN Plasmidique par Lyse Alcaline (E.coli )

Solutions utilisées Sol. I – Tampon de suspension Tris HCl - Tampon, protège les acides nucléiques EDTA - Chélates Mg++, empêche les nucléases de fonctionner Sol. II – Solution de lyse NaOH - ^pH lyse cellulaire, dénature ADN SDS - dissous membranes, denture et lie protéines

Solutions utilisées (suite) Sol. III- Acétate de potassium Renaturation de l’ADN Précipite SDS Précipite ADN génomique et protéines Isopropanol / Éthanol Précipite acides nucléiques (plasmide et ?) Sels demeurent solubles TE-RNase - Tris & EDTA encore; RNase??

Quantification de l’ADN Déterminer la Conc. d’ADN A260 de 1.0 = 50µg/mL ou 50ng/µL Déterminer la quantité d’ADN 1mL d’une solution avec une A260 de 1.0 contient 50µg ADN 1µL d’une solution avec une A260 de 1.0 contient 50ng ADN Ne pas oublier de prendre en considération le FACTEUR DE DILUTION

Problèmes Vous avez un échantillon d'ADN dont une dilution de 1/50 a un abs. 260 de 0.4. Quelle est la concentration d'ADN originale en µg/µL? 1 µg/µL Quel volume de l'échantillon non dilué auriez-vous besoin pour avoir 10μg? 10 µL Vous avez une solution d'ADN à 20μg/mL. Par quel facteur cette solution doit-elle être diluée pour obtenir un abs. 260 sur 0.01 40X

Électrophorèse sur gel d’agarose Séparation de molécules d’acides nucléiques simples ou doubles brins d’après la taille et la conformation Sépare les fragments entre 100pb et 10 Kbp Pouvoir de résolution entre fragments ≥100pb

Plasmide non digéré sur gel - Plasmide non digéré sur gel - Les plasmide non digérés génèrent un patron de bandes La migration est une fonction de la taille et de la conformation Super enroulé Relâché Multimèrs? multimèrs relâché Super enroulé +

Migration d’ADN linéaire-plasmide digéré La vitesse de migration est une fonction de la taille Les plus petits fragments migrent plus rapidement La vitesse de la migration est inversement proportionnelle au log10 de la taille

Migration d’ADN linéaire-plasmide digéré 1000 bp 850 bp 750 bp 600 bp 200 bp 100 bp +

Déterminer les tailles des fragments Fingerprinting Standard Curve: Semi-log Étape 1 Générer une courbe étalon à partir de l’échelle de tailles moléculaires Déterminer la distance de migration qui correspond à chaque taille Taille (pb) Distance (mm) 10 000 1 8 000 1.3 6 000 1.6 5 000 1.9 4 000 2.2 3 000 2.7 Etc

Déterminer les tailles des fragments Fingerprinting Standard Curve: Semi-log Étape 2 Entrer les données dans Excel Covertir les tailles en log

Déterminer les tailles des fragments Fingerprinting Standard Curve: Semi-log Étape 3 Générer la courbe dans Excel

Déterminer les tailles des fragments Fingerprinting Standard Curve: Semi-log Étape 4 Déterminer les tailles inconnues d’après les distances de migrations 3.55 Prendre l’inverse du log pour obtenir la taille 103.55 = 3548 bp

Visualisation: Bromure d’éthidium Colorant utilisé pour rendre les acides nucléiques visibles Fluorescents sous les UV Liaison proportionnelle à La taille La quantité La conformation

Que peut-on déterminer d’une électrophorèse sur gel d’agarose? Est-ce qu’il y a de l’ADN Combiens de conformations Combien de fragments Taille des fragments Taille totale des molécules d’acides nucléiques Nombre de coupures Linéaire? Circulaire?