Zones effectives de tampons biologiques pH et tampons Titrage et zones tampon Zones effectives de tampons biologiques

Remises des travaux remettez le cahier avec le compte rendu SVP, pas de pochette assurez-vous que le compte rendu soit complet

Correction des travaux respectez l'espace alloué - essayer d'être concis et précis, trop d'info dilue le message l'utilisation de Wikipedia comme référence sera pénalisée l'affirmation de choses (parfois farfelues) sans référence - sera pénalisée portez attention aux titres des figures/tableaux inclure les originales et non des photocopies

Correction des travaux évitez de faire des comparaisons sans utiliser des statistiques pour appuyer (ex: % erreur) e.g. Ne pas écrire: "Les valeurs se ressemblent, alors on a bien manipulé". "Les valeurs ne se ressemblent pas, alors on a dû faire une erreur de manipulation".

Ménage - rappel listes de matériel/tâches (à cocher chaque journée) Ex. nettoyer autour de la balance remplir boîtes d'embouts (gants) remplir les flacons laveurs vider les poubelles de table

Sécurité - gants apportez plus qu'une paire de gants durée de vie ~30-40 min pas de gants en vinyle

Courriels les coordonnateurs ne répondront pas aux courriels des étudiants si vous avez des questions, vous devez passer au bureau du coordonnateur s'adresser au coordonnateur qui vous a enseigné la séance

Plan du cours objectifs spécifiques «...développer...sens de l’organisation et... planifier leur expérimentation...»

réviser les notions de pH étudier un tampon Tampons - buts réviser les notions de pH étudier un tampon zones tampon de phosphate

Tampons - objectifs réviser le concept de pH utiliser l'équation de Henderson-Hasselbalch tampon TRIS: i) préparation ii) propriétés apprendre à utiliser un pH mètre

Tampons - objectifs effectuer un titrage et le suivre en utilisant un pH mètre tracer une courbe de neutralisation TRÈS important de comprendre le concept de la zone effective d’un tampon !

1 3 pH - révision normalité -nombre d’équivalents de base ou d’acide /L équivalent -1 mole de groupements basiques ou acides Exemples: 1 M NaOH = _____ N NaOH 1 M H3PO4 = _____ N H3PO4 1 3

E(eq) = V(en L) x N E(meq) = V(en ml) x N pH - révision calcul du # d'équivalents(eq) E(eq) = V(en L) x N calcul du # de milliéquivalents(meq) E(meq) = V(en ml) x N

pH - révision # de eq et meq dans 20 ml d’une solution 0,1 N? E = V x N = 0,02 L x 0,1 N = 0,002 eq = 20 ml x 0,1 N = 2 meq

pH - révision point d'équivalence - point où la neutralisation d’un groupement est complète pH pH = -log [H+] Kw Kw = [H+] [OH-] = 10-14 pour eau pur: [H+] = [OH-] = 10-7 M

Acides/bases forts dissocié à 100% [H+] = [HA] pour les acides forts [OH-] = [base] pour les bases fortes

Acides/bases forts - exemples HCl 0,01 N HCl donne [H+] = 0,01 M pH = -log (0,01) = 2 NaOH 0,01 N NaOH donne [OH-] = 0,01 M pH = ?

Acides/bases forts - exemples HCl 0,01 N HCl donne [H+] = 0,01 M pH = -log (0,01) = 2 NaOH 0,01 N NaOH donne [OH-] = 0,01 M pH = -log [H+] Kw = [H+] [OH-] = 10-14

Acides/bases forts - exemples HCl 0,01 N HCl donne [H+] = 0,01 M pH = -log (0,01) = 2 NaOH 0,01 N NaOH donne [OH-] = 0,01 M pH = -log [H+] = -log ( Kw / [OH-] ) = -log (10-14 / 10-2) = 12

HA  H+ + A- Acides/bases faibles faiblement ionisés en solution un équilibre s’établit entre l’acide et sa base conjuguée HA  H+ + A- acide base conjuguée

-log[H+] = -log Ka + -log [HA] Acides/bases faibles à l'équilibre on peu définir le constant KA HA  H+ + A- KA = [H+] [A-] [HA] en réarrangeant et en prenant le log négatif, -log[H+] = -log Ka + -log [HA] [A- ]

-log[H+] = -log Ka + -log [HA] Acides/bases faibles -log[H+] = -log Ka + -log [HA] [A- ] pH = -log [H+] pKa = -log Ka en faisant les substitutions pH = pKa + log [A-] [HA]

pH = pKa + log [A-] [HA] Acides/bases faibles relie le pH d’une solution d’un acide faible à son Ka et au rapport base conjuguée/acide équation de Henderson-Hasselbalch Ka est un constant d'équilibre, alors tout qui va l'affecter (p.ex. température, force ionique) affectera aussi le pH du tampon

Ka et pKa Ka = constante d'équilibre plus Ka est large = plus de dissociation, plus l'acide est fort pKa = -log Ka plus le pKa est petit, plus l'acide est fort

HA  H+ + A- Ka = [H+] [A- ] [HA] pKa = -log Ka Ka et pKa Ex: pKa Ka 3 0,001 2 0,010 1 0,100 0,3 0,500 plus faible plus fort

Solutions tampon capacité de préserver leur pH lors de l’ajout de quantités significatives d’acide/base contiennent un acide faible (HA) et sa base conjuguée (A-) zone effective: pKa ±1 (détails à venir)

Tampons et biochimie les substances biologiques sont très susceptibles aux variations de pH besoin d’un environnement stable où le pH est insensible à l’ajout d’acides ou de bases en biochimie c’est les tampons qui sont responsables de maintenir le pH constant

[H+] = (1 x 10-5L)(1M) = 10-5 M, alors pH = -log 10-5 = 5 Tampons et biochimie 1 L d'eau ajouter une gouttelette (10 μl) de HCl 1 M pH de descend de 7 à 5 = changement de 100X dans [H+] Eau pur: [H+] = 10-7 M, alors pH = -log 10-7 = 7 Eau + 10 μl HCl 1 M: [H+] = (1 x 10-5L)(1M) = 10-5 M, alors pH = -log 10-5 = 5 1L

pH = pKa + log [A-] [HA] Zone tampon une solution tampon a la capacité de préserver son pH lors de l’ajout d’acide/base si [HA] = [A-], pH = pKa + log 1 = pKa

Zone tampon une solution tampon a la capacité de préserver son pH lors de l’ajout d’acide/base centre du zone tampon pKa [HA] = [A-] pH pH < pKa (= plus acide) [HA] > [A-] pH > pKa (= plus basique) [HA] < [A-]

Zone tampon l'équation d'Henderson-Hasselbalch: pH = pKa + log [A-] [HA] acide hypothétique où pKa = 7 [A-]/[HA] varie de 0,05 à 0,95 (= ajoute d’OH-) avec H-H, calculer le pH des solutions

Zone tampon pKa = 7; 0,05 ≤ [A-]/[HA] ≤ 0,95

Zone tampon pKa = 7; 0,05 ≤ [A-]/[HA] ≤ 0,95

Zone tampon pKa = 7; 0,05 ≤ [A-]/[HA] ≤ 0,95

Zone tampon plus on approche au pKa, moins est la pente (ΔpH par unité de [A-]/[HA] ) c.-à-d. le pH change moins par ajoute de base un tampon

Zone tampon un tampon le centre du zone effective d'un tampon est le pH qui est égale au pKa

[A-] = [HA] quand pH = pKa Zone tampon le centre du zone effective d'un tampon est le pH qui est égale au pKa [A-] = [HA] quand pH = pKa

Pouvoir d'un tampon tampon phosphate (H2PO4- ; pKa 7,21) H2PO4- ↔ HPO4-2 + H+ 1 L de tampon [H2PO4-] = [HPO4-2] = 0,05 M pH = ? [HA] [A-]

Pouvoir d'un tampon tampon phosphate (H2PO4- ; pKa 7,21) H2PO4- ↔ HPO4-2 + H+ 1 L de tampon [H2PO4-] = [HPO4-2] = 0,05 M pH = pKa + log [A-]/[HA] = 7,21 + log (0,5)/(0,5) = 7,21 la solution du tampon est au pH = pKa [HA] [A-]

Pouvoir d'un tampon ajoutez 10 ml de HCl 1 M pH = ?

moles H+ = (0,01 L)(1 M) = 0,01 moles Pouvoir d'un tampon 10 ml de HCl 1 M équivaut: moles H+ = (0,01 L)(1 M) = 0,01 moles les H+ réagissent avec la base (HPO4-2) du tampon H+ + HPO4-2 ↔ H2PO4- 0,01 moles

moles H+ = (0,01 L)(1 M) = 0,01 moles Pouvoir d'un tampon 10 ml de HCl 1 M équivaut: moles H+ = (0,01 L)(1 M) = 0,01 moles les H+ réagissent avec la base (HPO4-2) du tampon H+ + HPO4-2 ↔ H2PO4- 0,01 moles -0,01 moles +0,01 moles au début [H2PO4-] = [HPO4-2] = 0,05 M maintenant: [H2PO4-] = 0,05 + 0,01 = 0,06 M [HPO4-2] = 0,05 - 0,01 = 0,04 M

Pouvoir d'un tampon ajouté 10 ml de HCl 1 M à 1L de tampon phosphate où [H2PO4-] = [HPO4-2] = 0,05 M et le pH de la solution = 7,21 pH=pKa+log[A- ]/[HA] = 7,21+ log(0,04)/(0,06) = 7,03 l'ajout de 10 ml d'acide à 1L de tampon change le pH par 0,18

pH = -log [H+] = -log (0,01 L)(1 M) = 2 Pouvoir d'un tampon l'ajoute de 10 ml de HCl 1 M à 1 L d’eau abaissera le pH de 7 à 2 !!! pH = -log [H+] = -log (0,01 L)(1 M) = 2 (1 L)

Pouvoir d'un tampon l'ajoute de 10 ml de HCl 1 M à 1 L de: -tampon abaissera le pH par 0,18 -eau abaissera le pH par 5 TRÈS IMPORTANT EN BIOCHIMIE!!!

pH mètre l’instrument qui mesure le pH instructions dans les n de c (5 modèles) -calibrage -rinçage -utilisation dans la préparation d’un tampon

pH mètre - utilisation doit être calibré avant utilisation à l'aide de solutions standards (pH 4, 7 et 10) Utilisation -exposer à l'air le trou -rincer/éponger l'électrode entre chaque solution -ne jamais laisser l'électrode à l'air, toujours dans son tampon d'entreposage -refermer le trou après l'utilisation

Titrage addition de petits aliquotes de base ou d’acide fort facilement suivi en surveillant le pH résultats utiliser pour produire une courbe de titrage

Courbe de titrage - acide acétique HOAC + H2O AcO- + H3O+ OH-

Courbe de titrage - acide acétique HOAC + H2O AcO- + H3O+ AcO- / HOAC augmente pH = pKa + log ( AcO- / HOAC ) le pH monte avec l'ajout de OH-

Courbe de titrage - acide acétique HOAC + OH- AcO- + H2O [HOAc] = [AcO-] pKa zone = pKa 1 AcO- HOAc

Courbe de titrage - acide acétique HOAC + OH- AcO- + H2O

Point d'équivalence point ou la neutralisation d'un groupement ionisation est complet

Point d'équivalence point ou la neutralisation d'un groupement ionisation est complet point d’inflexion dans la région ou le pH change rapidement avec l’ajoute d'acide/base

Point d'équivalence - détermination méthode des tangentes (Gavrilovic Ch. 6)

Point d'équivalence - détermination dérivée (ΔpH/Δml) points d'équivalence

Dérivée calculer ΔpH/Δml de titrant ajoutés tracer la courbe de ΔpH/Δml en fonction de la volume de titrant ajouté

Dérivée X Y

Dérivée 11,6 ml 21,8 ml

Dérivée - précision Courbe de titrage Dérivée

Points techniques - dérivée il faut que le tracé graphique soit précis près du point d’équivalence verser des petits volumes de la solution de titrage dans cette zone de pH (c.-à-d. dans le zone de « saut de pH » )

Points techniques - dérivée titrage d'acide acétique

Points techniques - dérivée titrage de phosphate

Points techniques - dérivée titrage de phosphate

Titrage de phosphate (Na3PO4) 3 groupements ionisables = 3 zones tampon PO43- + H+  HPO42- + H+  H2PO4- + H+  H3PO4 point d'équivalence

Titrage de phosphate (Na3PO4) 3 groupements ionisables = 3 zones tampon PO43- + H+  HPO42- + H+  H2PO4- + H+  H3PO4 point d'équivalence

Titrage de phosphate (Na3PO4) 3 groupements ionisables = 3 zones tampon PO43- + H+  HPO42- + H+  H2PO4- + H+  H3PO4 point d'équivalence

Titrage de phosphate (Na3PO4) 3 groupements ionisables = 3 zones tampon PO43- + H+  HPO42- + H+  H2PO4- + H+  H3PO4 point d'équivalence

Titrage de phosphate (Na3PO4) 3 groupements ionisables = 3 zones tampon 3 pKa X X X

Titrage - détermination de la [PO43-] PO43- + H+  HPO42- + H+  H2PO4- + H+  H3PO4 point d'équivalence

Titrage - détermination de la [PO43-] HPO42- + H+  H2PO4- point d'équivalence #1 point d'équivalence #2 10,2 ml 10,2 meq volume de HCl 1N (ml) ou meq HCl

Titrage - détermination de la [PO43-] HPO42- + H+  H2PO4- 10,2 meq [PO43-] initiale: eq =V x N, alors N = eq / V (au début) = 0,0102 eq / 0,1 L = 0,102 N = 0,102 M 10,2 meq

Titrage - détermination de la [PO43-] HPO42- + H+  H2PO4- 10,2 ml 0,0102 moles (0,0102 L x 1M) [PO43-] initiale: [PO43-] = moles PO43- / V (au début) = 0,0102 moles / 0,1 L = 0,102 M 0,0102

Plan expérimental Exercice A1 normalité calculs faire d’avance dans compte rendu

Faire vérifier la quantité de TRIS à peser AVANT de commencer. Plan expérimental Exercice A2 préparer un tampon TRIS étudier les effets sur ce tampon de: -température -force ionique -dilution -pH + pKa Faire vérifier la quantité de TRIS à peser AVANT de commencer.

Plan expérimental Exercice B titrage de Na3PO4 avec HCl 1N

Point technique - préparation d'une solution Mettre 3/4 du volume H2O. Barreau magnétique + agiter. Dissoudre les poudres etc. Ajuster le pH. Compléter au volume.

Points techniques - TRIS ouvrir le trou sur l'électrode au début fermer le trou à la fin ne jamais laisser l'électrode dans l'air bien rincer l’électrode entre les lectures dans l’exercice TRIS

Points techniques - titrage Lunettes et gants obligatoire rincer la burette avec HCl 1N avant s’assurer d’avoir enlevé la bulle d’air verser de petits volumes (˂0,5 ml) dans les zones qui correspondent à un saut de pH bien rincer la burette avec de l’eau distillée après laisser à l’envers avec le robinet ouvert récupération PO4/HCl (pH ˂ 2 !!)

Ordre des manips un étudiant prépare le tampon TRIS pH 7,5 en parallèle l'autre prépare le titrage le 1er poursuit avec les traitements de l’exercice TRIS, mais ne fait pas les lectures le 2e effectue le titrage une fois le titrage est compléter, le 1er effectue ses lectures de pH pendant que l'autre fait le ménage

Compte rendu BCM111/113 exercice A1 (calculs normalité) exercice A2 (TRIS) exercice B (titrage) compléter les feuilles

Compte rendu - TRIS présenter vos résultats sous forme d'un seul tableau (Q3) tableau clairement identifié (titre/unités/etc) devrait se comprendre tout seul (c.-à-d. indiquer le traitement) Exercice F discuter les différences, s’Il y a lieu, entre le changement de pH pour la première ajoute de 100 µl d’acide (ou de base) et la deuxième

tracer la courbe de neutralisation (Excel ou GraphPad) Compte rendu - titrage tracer la courbe de neutralisation (Excel ou GraphPad) clairement indiquer les: ● postions des pKa ● formes chimiques de Na3PO4 aux divers pKa ● points d’équivalence (2) ● régions où une solution phosphate à un effet tampon ● axe des X: (i) en méq de HCl 1 N; et, (ii) en ml de HCl 1 N Présentation Powerpoint disponible sur Moodle: comment mettre 2 axes à l'aide d' Excel.

pH et tampons - questions Zones tampon de phosphate Zones effectives de tampons biologiques

BCM111 - Gp 2 30 janvier = carnaval = pas de cours labo sera repris mardi le 29 janvier à 18h remise du compte rendu à l'heure normale (16h vendredi)