UE9 Gestion du risque microbiologique M1 nutraceutique UE9 Gestion du risque microbiologique 4 mars 2009 Méthodes moléculaires en Microbiologie Emmanuel BERTRAND

Plan Besoins Contraintes industrielles Marché de l’analyse Microbiologique Intérêt des outils de biologie moléculaire Méthodes moléculaires Exemples : Secteur Agro-alimentaire : Détection Secteur Pharmaceutique/Cosmétique : Identification Secteur environnement : Quantification Secteur vétérinaire : Screening Autres technologies

A chaque secteur d’activité correspond une demande particulière. 1- Besoins A chaque secteur d’activité correspond une demande particulière. - Secteur Agro-alimentaire : Détection - Secteur Pharmaceutique/Cosmétique : Identification - Secteur environnement : Détection et Quantification - Secteur vétérinaire : Screening et Détection

1- Besoins – Secteur Agro-alimentaire Détection (ex. Listeria monocytogenes, Salmonella, E. coli O157:H7,…) - Savoir si le produit est propre à la consommation - Besoin d’avoir un résultat le plus rapidement possible - Utiliser des outils accrédités - Méthodes standardisées pour tous types de matrices et de pathogènes - Coûts d’analyse < 5€ (PCR) et < 1€ (Bactériologie classique)

1- Besoins – Secteur Pharma/Cosmétique Présence et Identification - Savoir si le produit contient des micro-organismes - Déterminer le genre et l’espèce du contaminant - Pas de contraintes de temps d’analyse - Utilisation de systèmes internes et commerciaux dans un cadre normatif - Coûts d’analyse > 50€

1- Besoins – Secteur Environnement Détection et quantification - Recherche d’un genre et/ou d’une espèce - Quantifier la flore recherche - Contraintes de temps d’analyse (pb Santé publique) - Utilisation de systèmes internes et commerciaux dans un cadre normatif - Coûts d’analyse = 30€

1- Besoins – Secteur Vétérinaire Détection et Screening - Recherche d’une espèce et/ou identification du sérotype - Contraintes de temps d’analyse (pb Santé publique) - Utilisation de systèmes internes et commerciaux dans un cadre normatif - Coûts d’analyse = 20€

2- Contraintes industrielles Risque sanitaire potentiellement élevé en raison des volumes produits Une crise sanitaire = Coûts élevés voir une fermeture de site Le coût d’analyse est fonction du PRI du produit Le temps d’analyse (TTR) est déterminé par la durée de vie du produit et les coûts de stockage En fonction des secteurs d’activité, les niveaux d’expertise sont très disparates. Agroalimentaire < Vétérinaire < Pharma/Cosmétique

2- Contraintes industrielles - Matrices Les outils doivent être adaptés pour une large gamme de matrices Agroalimentaire : Produits carnés, ovo produits, produits laitiers, produits de la mer, végétaux, … Pharma/Cosmétique : Poudres, détergents, principes actifs, … Environnement : Eaux, air, surfaces, … Vétérinaire : Sang, organes, fèces, urines, … Implique : Robustesse vis-à-vis des agents inhibiteurs de PCR contenus dans les matrices (sels, détergents, phénol, matières grasses, colorants, nombreux facteurs protéiques, antibiotiques, …) Protocoles adaptés aux différents types de matrices (Liquides, solides, gazeuses, …)

2- Contraintes industrielles – Prises d’essais Prises d’essais standardisées ? 25g de matrices (Matrices alimentaires) 100mL à 1L de liquide (Matrices environnementales) Véto: adaptées en fonction du statut de l’infection (sang, organes, urines, lait, …) Pharma/cosméto : adaptées en fonction de l’état physique de la matrice et des normes internationales L’enrichissement est nécessaire en dehors d’un statut d’infection (à l’exception des eaux).

1- Marché de l’analyse microbiologique Volume et valeur marché global 109 M tests 801 M$

1- Marché de l’analyse microbiologique Méthodes utilisées sur le marché mondial Sur le plan mondial les méthodes immunoassay (PDM 35%) sont devant la PCR (PDM 10% = 15M tests)

1- Marché de l’analyse microbiologique Pathogènes 2005 Pathogènes 2010 Hard Hard PCR 10Mtest (9,2%) Immunoassay 37,8Mtest (34,4%) PCR 25Mtest (17,1%) Immunoassay 57,3Mtest (39,4%) Méthode traditionelle 62Mtest (56,5%) Méthode traditionelle 64,7Mtest (44%) Easy Easy Fast Slow Fast Slow 110M tests Croissance mondiale PCR +150% de 2005 à 2010

1- Marché de l’analyse microbiologique Tendance et demande marché sur Diagnostic microbiology Food En 2000 = sensibilité méthode et robustesse Depuis 2005 Rapidité des tests (83%) tendance TTR 24h Reconnaissance méthode Diminution des coûts par test Augmentation du nombre de tests (pression client et réglementaire) Performance désirée Tendance future 2010 Reconnaissance méthode Ultra Rapidité des tests tendance TTR <24h, 8h Diminution des coûts par test Simplification méthode

2- Intérêts des outils de biologie moléculaire Avantages : Sensibilité > méthodes traditionnelles Spécificité TTR (Time to result) < méthodes traditionnelles Automatisation possible Inconvénients : Coûts Praticabilité Robustesse

2- Intérêts des outils de biologie moléculaire Utilisation actuelle : Diagnostic d’urgence, de libération Suivis de site (TAR, surface,…) Suivi du produit dans son process de fabrication Identification bactérienne Utilisation souhaitée : - Analyses de routine

2- Intérêts des outils de biologie moléculaire

2- Intérêts des outils de biologie moléculaire A) Trouver "une aiguille dans une botte de foin". B) Photocopieuse à ADN. amorce gène cible A) Spécificité du signal 40 cycles B) Amplification du signal Pour 1 copie initiale on obtient en fin de PCR k.2n copies au final. 240 = 1012 copies

3- Méthodes moléculaires PCR Temps réel (vs PCR classique) Détection Quantification Suivi Marchés : Agroalimentaire et environnement Identification (PCRs, Séquençage, Puces,…) Marchés : Pharmaceutique et cosmétique

+ + + PCR conventionnelle versus PCR quantitative 3- Méthodes moléculaires – Détection PCR conventionnelle versus PCR quantitative PCR conventionnelle Pièce n°1 Pièce n°2 + + + PCR quantitative

Le résultat : PCR conventionnelle versus PCR quantitative 3- Méthodes moléculaires – Détection PCR conventionnelle versus PCR quantitative Le résultat : PCR conventionnelle PCR quantitative - + M A B C 3 2 1 - PV automatique - Sauvegarde informatique de l’analyse et du résultat

La PCR quantitative 3- Méthodes moléculaires – Détection Il existe plusieurs types de marquage Marquage non spécifique Marquage spécifique sondes d’hydrolyse - sondes d’hybridation

3- Méthodes moléculaires – Détection Le choix des chimies s’effectue en fonction : des licences du coût de l’application

Marquage non spécifique 3- Méthodes moléculaires – Détection Marquage non spécifique La chimie SyBr Green® Marquage non spécifique de l’ADN double brin Augmentation du signal x1000 quand la molécule est liée Produit par Molecular Probe Possibilité réduite pour faire du multiplexage

Intercalants de l’ADN 3- Méthodes moléculaires – Détection Colorants non spécifiques Se lient à l’ADN double brin (au niveau du petit sillon) Ne fixe pas l’ADN monobrin SYBR Green (x10,x25 plus sensible que le BET) Bromure d’éthidium Souvent utilisé pour les courbes de fusion

Les sondes d’hydrolyse Les sondes d’hybridation 3- Méthodes moléculaires – Détection Les sondes marquées Les sondes d’hydrolyse Les sondes d’hybridation Les amorces fluorescentes Importance du moment de l’enregistrement du signal

Les sondes marquées 3- Méthodes moléculaires – Détection R « Reporter » « Quencher » l Q nm Absorbtion Fluorescence 475 550 R = FAM 600 Q = TAMRA

Les sondes marquées 3- Méthodes moléculaires – Détection Eloignement « Quenching » Lyse

Système Taqman® 3- Méthodes moléculaires – Détection Utilisation d’une Taq polymerase avec une activité exonucléasique La sonde s’hybride avec la cible La polymerase clive la sonde Le reporter est éloigné du quencher et l’on observe une augmentation du signal.

Technologie des sondesTaqMan® MGB 3- Méthodes moléculaires – Détection Technologie des sondesTaqMan® MGB  - MGB : Minor Groove Binder - Sonde courte , Tm élevé

Technologie des sondes LNA 3- Méthodes moléculaires – Détection Technologie des sondes LNA LNA : Locked Nucleic Acids Bases nucléotidiques modifiées. Présence d’un groupement méthylène Augmentation du Tm Utilisés pour : Taqman FRET Molecular Beacons

Molecular beacons 3- Méthodes moléculaires – Détection Configuration en épingle à cheveu Hybridation avec la cible pendant la phase d’élongation Le reporter est éloigné du quencher et l’on observe une augmentation du signal Utilisés dans les kits IQ-Check, ADIAFood,…

FRET 3- Méthodes moléculaires – Détection Fluorescent Resonance Energy Transfer Utilise deux sondes marquées L’énergie est transferrée entre les deux sondes marquées Technologie Roche

3- Méthodes moléculaires – Détection Scorpions ®

3- Méthodes moléculaires – Détection Scorpions ®

Quantification absolue 3- Méthodes moléculaires – Quantification Quantification absolue Quantification avec une gamme étalon. Sur un même run PCR on analyse l’échantillon en même temps que la gamme étalon. Pour plus de justesse, l’étalon doit être de même nature (ADN génomique, plasmide, ARN, …) que la cible.

Quantification absolue 3- Méthodes moléculaires – Quantification Quantification absolue 2.5 105 2.5 104 2.5 103 2.5 102 Equation de la gamme étalon : y = -3.49.Log(X) + 36.75 Le Ct de l’échantillon est de 22.38 soit 13100 copies initialement présentes dans l’échantillon. La quantité peut être massique ou en copie, UG (unité génomique)…

3- Méthodes moléculaires – Identification L’identification

3- Méthodes moléculaires - Identification Les techniques dérivées de la PCR Nested PCR -1ère PCR « consensus » du gène cible (ex. Genre) -2ème PCR « spécifique » de la cible recherchée (ex. Espèce) -Augmentation de la sensibilité -Risque de contamination

(Restriction Fragment Length Polymorphism) 3- Méthodes moléculaires - Identification Les techniques dérivées de la PCR PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) -Utilisation du polymorphisme des sites de restriction Listeria monocytogenes Listeria ivanovii Escherichia coli O157H7 BglII BamHI SalI HindIII BglII + BamHI BglII + SalI Produit de PCR

3- Méthodes moléculaires - Identification Les techniques dérivées de la PCR Multiplex PCR Ce système permet l’amplification de plusieurs cibles dans un même tube réactionnel. Le mix comprend : -1 à plusieurs jeux d’amorces -Une sonde par cible -Attention aux compétitions et au choix des fluorophores Exemple : Triplex Mycoplasmes aviaires (ADIAVET) M. synoviae (FAM) M. gallisepticum (Cy5) IPC (HEX)

Polymorphisme d’amplification des génomes 3- Méthodes moléculaires - Identification Les techniques dérivées de la PCR PCR RAPD Polymorphisme d’amplification des génomes Individu A Individu B

3- Méthodes moléculaires - Identification Le séquençage Séquençage automatisé Haut débit Niveau d’expertise moyen Equipement lourd Utilisé par le Pharma/Cosméto/Prestataires de service

3- Méthodes moléculaires - Identification Le séquençage Préparation de l’échantillon Enrichissement Isolement

3- Méthodes moléculaires - Identification Le Pyroséquençage Faible débit d’analyse Niveau d’expertise moyen Coûts moyens Utilisé par le Pharma/LNR/Prestataires de service Préparation de l’échantillon Enrichissement Isolement Biotage

3- Méthodes moléculaires - Identification Le Pyroséquençage

3- Méthodes moléculaires - Identification Les puces

Les puces : Macroarray (Faible débit) 3- Méthodes moléculaires - Identification Les puces : Macroarray (Faible débit) Préparation de l’échantillon Enrichissement facultatif Extraction et purification Reverse Transcription Analyse sur puce Matériel de base Niveau d’expertise moyen Utilisée par certains LVD et LNR Taille des spots : 100µm 1000 à 10 000 spots/cm² Colorimétrie ou fluorescence

Les puces : Microarray spottée (Haut débit) 3- Méthodes moléculaires - Identification Les puces : Microarray spottée (Haut débit) Préparation de l’échantillon Enrichissement facultatif Extraction et purification Reverse Transcription Taille des spots : 100µm 1000 à 10 000 spots/cm² Fluorescence Analyse sur puce Equipement lourd Niveau d’expertise élevé Qqs Laboratoires prestataires maîtrisent cet outil

Les puces : GeneChips Affimetrix 3- Méthodes moléculaires - Identification Les puces : GeneChips Affimetrix Préparation de l’échantillon Enrichissement facultatif Extraction et purification Reverse Transcription Analyse sur puce Taille des spots : 20µm 250 000 spots/cm² Fluorescence Equipement lourd Niveau d’expertise élevé

3- Méthodes moléculaires – Les limites de la PCR - Risques de contamination Risques d’inhibitions Faux positifs Faux négatifs

3- Méthodes moléculaires – Les limites de la PCR Les faux positifs Peuvent intervenir à tous les stades de la PCR : Préparation de l’échantillon Préparation du mélange pré-PCR Ajout de l’échantillon

ADN amplifié : quel risque ? 3- Méthodes moléculaires – Les limites de la PCR ADN amplifié : quel risque ? 100 µl de produits amplifiés = 1012 copies d’ADN 100 µl = 400 copies d’ADN Bassin olympique (50 x 25 x2)

Les contaminations inter échantillons 3- Méthodes moléculaires – Les limites de la PCR Les contaminations inter échantillons Lors de la préparation des échantillons Lors de la détection

3- Méthodes moléculaires – Les limites de la PCR Comment décontaminer ? Isopsoralen U.V. Eau de javel Produits commerciaux Système Uracyl-N-Glycosylase / dUTP

3- Méthodes moléculaires – Les limites de la PCR Comment décontaminer ? Par Irradiation

3- Méthodes moléculaires – Les limites de la PCR Comment décontaminer ? Inactivation par utilisation de l’UNG

Les faux positifs : les contrôles 3- Méthodes moléculaires – Les limites de la PCR Les faux positifs : les contrôles Lors de la préparation de l’échantillon (lyse cellulaire) : contrôle négatif d’extraction Lors de la préparation du mélange d’amplification : contrôle négatif d’amplification Absence de faux positifs

3- Méthodes moléculaires – Les limites de la PCR Les faux négatifs Origines Erreur dans le mélange pré-PCR ou dysfonctionnement du thermocycleur - Présence d’inhibiteurs dans l’échantillon Solutions Contrôle positif d’amplification - Contrôle interne d’amplification Absence de faux négatifs

3- Méthodes moléculaires - IPC Le contrôle interne Un contrôle interne est une molécule d’ADN ou d’ARN qui va être amplifié en même temps que la cible recherchée contrôle interne d’amplification contrôle interne de purification -contrôle interne d’extraction

ADN génomique, Plasmide, Nucléotide 3- Méthodes moléculaires - IPC Le contrôle interne IPC Type Moment d'ajout Contrôle Contrôle interne d'amplification ADN génomique, Plasmide, Nucléotide Présent dans le mix PCR Contrôle de l'inhibition de la réaction de PCR Contrôle interne de purification Ajouter lors de l'étape de lyse ou de purification Contrôle de l'inhibition de la réaction de PCR, de l'absence de dégradation d'ADN, de l'absence de perte lors de la purification Contrôle interne d'extraction ADN de l'échantillon (Cellules hôtes, tissus,…) Contenu dans l'échantillon Contrôle de l'inhibition de la réaction de PCR, de l'absence de dégradation d'ADN, de l'absence de perte lors de la purification, de l'efficacité de lyse sur l'échantillon.

3- Méthodes moléculaires - IPC Le contrôle interne : Construction la molécule d ’ADN cible Modification de la molécule d ’ADN cible Co-amplification des deux molécules avec les mêmes amorces Mélange PCR Hybridation Amplification

3- Méthodes moléculaires - IPC Le contrôle interne : Construction (2)

3- Méthodes moléculaires - Compétition Quantité constante de contrôle interne = 2000 molécules Quantité croissance de bactéries de 0 à 106 100 10 103 104 105 106 1 Contrôle interne 500 pb Cible PCR 221 pb

3- Méthodes moléculaires - Compétition Cas d’une PCR où la cible et l’IPC sont co-amplifiés avec le même couple d’amorces mais une sonde différente. Cible marquée en FAM IPC marqué en VIC

3- Méthodes moléculaires - Normalisation dRn : avec normalisation Signal fluorescent normalisé par une référence fluorescente passive R : sans normalisation

3- Méthodes moléculaires - Normalisation reporter (Fam) Rn = Référence passive (Rox) Echantillon 1 Echantillon 2 Fam Fluorescence Rn Fam Fluorescence ROX Rn ROX

3- Méthodes moléculaires - Normalisation Intérêt de la normalisation : Harmonisation pour le positionnement du Threshold Quantification absolue et relative

4- Exemples – Secteur Agroalimentaire Recherche de E. coli O157:H7 en viande hachée Seuil de détection 1 UFC/25g matrice Production Transformation Distribution Consommation 5 – 10 jours (temps de maturation) 2 – 10 jours

4- Exemples – Secteur Agroalimentaire 1CFU dans 25g 1 jour Enrichissement Croissance sélective Enrichissement PCR 8h 2h30 Etape 3 Amplification ADN & analyse Etape 1 Enrichissement Etape 2 Extraction d’ADN

Collecte de l’échantillon (25g) Milieu d’enrichissement (225mL) 4- Exemples – Secteur Agroalimentaire Etape 1 : ENRICHISSEMENT 25 g Collecte de l’échantillon (25g) Milieu d’enrichissement (225mL) Broyage Incubation (8h)

Etape 2 : EXTRACTION 4- Exemples – Secteur Agroalimentaire Lyse thermique (10 à 30 minutes 95°C) Lyse physique : Broyage, sonication, … Lyse chimique avec détergents ou résines (avec ou non une incubation) Lyse enzymatique (Protéinase K, Lysozyme,…) avec une étape d’incubation Le choix de la lyse : en fonction du pathogène recherché Pour certains pathogènes, on a recours à différentes méthodes de lyse Des étapes de clarification et de concentration peuvent être ajoutées en fonction de la matrice et de la vitesse de croissance bactérienne

Eliminer le surnageant Reprendre le culot dans 100µL Tp lyse 4- Exemples – Secteur Agroalimentaire Etape 2 : EXTRACTION Prélèvement de 1ml de bouillon Utilisation de tubes au format 96 Centrifugation 2min à 500g Prélever 500µL du surnageant Centrifugation 5min à 5000g Eliminer le surnageant Reprendre le culot dans 100µL Tp lyse

Transfert 10µL ADN extrait 4- Exemples – Secteur Agroalimentaire Etape 3 : DETECTION Mix PCR Transfert 10µL ADN extrait Distribution (15µL)

Etape 4 : Analyse 4- Exemples – Secteur Agroalimentaire En dehors d’expertise dans les IAA, l’analyse des données ne doit pas être fonction du facteur humain.

4- Exemples – Secteur Pharma/Cosméto Recherche de germes dans une crème de soin Altération du produit Santé du consommateur

Etape 1 : ENRICHISSEMENT 4- Exemples – Secteur Pharma/Cosméto Etape 1 : ENRICHISSEMENT Dilution au 1/10 en milieu liquide Incubation (24h)

Etape 2 : Filtration 4- Exemples – Secteur Pharma/Cosméto Filtration de 10 à 100mL sur membrane (porosité de 0.45µm)

Etape 3 : Extraction et purification 4- Exemples – Secteur Pharma/Cosméto Etape 3 : Extraction et purification Récupération des cellules collectées sur la membrane Lyse à l’aide d’automate Purification sur colonne de Silice

Etape 4 : Amplification 4- Exemples – Secteur Pharma/Cosméto Si présence Amplification de l’ADN extrait avec des amorces universelles pour Eucaryotes et Procaryotes (16S, 23S, …). Détection par électrophorèse ou par fluorescence non spécifique (SybrGreen) Préparation des mix PCR en automate

Etape 5 : Séquençage 4- Exemples – Secteur Pharma/Cosméto Préparation des mix PCR avec Dyes pour le séquençage Amplification et détection Obtention du spectre

Etape 6 : Analyse de séquence 4- Exemples – Secteur Pharma/Cosméto Etape 6 : Analyse de séquence Extraction de la séquence Interrogation des banques de données Identification

4- Exemples – Secteur Environnement Détection Legionella pneumophila et Quantification de Legionella spp Legionella spp est un indicateur de présence de Legionella pneumophila La présence de L. pneumophila entraine une action curative immédiate Réglementation sur la quantité de L. spp / Litre si < 1000 UFC/litre = pas d’action si compris entre 1000 et 10 000 UFC/litre = Action curative si > 100 000 UFC/litre = fermeture du site

4- Exemples – Secteur Environnement Prélèvement Filtration de 100mL à 1L sur membrane (porosité de 0.45µm)

4- Exemples – Secteur Environnement 1ère Etape : Lyse 1ml Tampon de lyse LB Ajouter la membrane pliée Incubation 20 min à 95°C Vortexer 15s Laisser à T° ambiante 2ème Etape : Clarification Déposer 550µl de lysat dans la colonne « Cleaning unit » Centrifugation 3 min à 7000g

4- Exemples – Secteur Environnement 3ème Etape : Purification et Concentration Ultrafiltration Lavage Lavage Déposer 500µl de filtrat dans la colonne Centrifugation 5 min à 7000g 200µL de Tampon CB1 Centrifugation 5 min à 7000g 200µL de Tampon CB1 Centrifugation 5 min à 7000g Compléter à 100µl avec le Tampon CB2 Stocker à +4°C ou à -20°C

4- Exemples – Secteur Environnement Réalisation d’une gamme étalon d’ADN génomique de L. pneumophila Run PCR avec en parallèle la gamme et les échantillons 2.5 105 2.5 104 2.5 103 2.5 102

4- Exemples – Secteur Vétérinaire

4- Exemples – Secteur Vétérinaire Diagnostique de la Fièvre Catarrhale Ovine Recherche du virus (Sentinelle) Identification du sérotype (Campagne de vaccination) Novembre 2007 Novembre 2008

Préparation du prélèvement (Sang sur EDTA) Si l’échantillon est positif en Groupe, il faut alors le typer Extraction et purification de l’ARN PCR avec Mix de Groupe Détermination du sérotype PCR avec Mix de Type

5- Autres technologies Cibles : Génome Transcriptome Protéome Phénotype

5- Autres technologies Cytométrie en flux : sur la cellule entière Marqueurs de viabilité (substrats couplés à des fluorophores : FITC, …) Marqueurs spécifiques par germe recherché (Recherche par AC marqués) Très rapide Coûts élevés

5- Autres technologies Puces à Protéines, Peptides, Anticorps Principe basé sur le test ELISA Marqueurs spécifiques par germe recherché (Recherche par AC marqués) Rapide Coûts fonction du nombre de spots

5- Autres technologies Spectromètrie de masse Reconnaissance en partie du Protéome Avec ou sans électrophorèse 2D Analyse de spectres En vogue Coûts élevés

5- Autres technologies Biolog : Analyse du phénotype Reconnaissance par le métabolisme Plaques 96 contenant différentes sources (sucres, sulfates, …)