Dr Francois Ghiringhelli Centre Georges Francois Leclerc Dijon Thérapies ciblées - Biothérapies (thérapie génique, immunothérapie…) Etat actuel - Profil de tolérance - Perspectives Dr Francois Ghiringhelli Centre Georges Francois Leclerc Dijon

1. Les thérapies ciblées

Plan 1/ La transduction du signal & cellules tumorales 2/ La transduction du signal & l’angiogénèse

Introduction:Transduction du Signal Le passage d’une cellule eucaryote de la phase quiescente (G0) à la phase de mitose (M), en réponse à des stimuli extérieurs est un processus multi-étape Il requiert la transduction de signaux divers et l’activation de protéines intracellulaires Ce processus finement régulé est altéré au sein des cellules néoplasiques, engendrant une prolifération, une migration et une différenciation cellulaire non contrôlée 3 étapes: Fixation sur un récepteur trans-membranaire d’un signal extra-cellulaire Activation de seconds messagers intra-cellulaires aboutissant à l’activation de facteurs de transcriptions qui vont pouvoir agir directement sur la transcription de gènes Cycle cellulaire

Ras-GDP Ras-GTP Membrane Cytoplasme Noyau K HER-1 (EGFR) Homodimères Hétérodimères PKC DAG PLCγ Gab-1 Endocytose IP3 HER PI3K Ras-GTP Ras-GDP Raf-1 Erk-2 Erk-1 Cytoplasme Shc Grb2 Sos K Dégradation lysosomale β1 α Importin α & β1 interaction Akt STATs C-Src Adhésion Migration FAK Facteurs de transcription Prolifération E2F1 STAT3 Prolifération Survie Survie Noyau Cycline D1

Récepteur Tyrosine Kinase R-TK Domaine extracellulaire (liaison avec le ligand) Domaine transmembranaire Domaine cytoplasmique (Activité tyrosine kinase)

Les Récepteurs Trans-Membranaires, des Cibles Thérapeutiques Il est actuellement décrit plusieurs familles de récepteurs tyrosine kinase (R-TK) qui se différencient par leur ligand et leur structure chimique mais qui possèdent des caractéristiques communes Famille de récepteur Classe I : ErbB / HER Classe II FGF Classe III HGF Classe IV  Insuline Classe V Neurotrophins Classe VI PDGF Ligand EGF, TGF, AR, HB-EGF, SDGF, Heregulin, Betacellulin FGF 1 à 8 Insuline, IGF-1 IGF-2 NGF BDNF NT-3 à 5 PDGF-A et B VEGF CSF-1 SCF PIGF Récepteur HER-1 HER-2 HER-3 HER-4 FGFR-1 FGFR-2 FGFR-3 FGFR-4 MET IR IGFI-R TRKA TRKB TRKC PDGFR alpha et béta CSF-1R SCFR FLT KDR

HER-1 (EGFR) Homodimères HER-2 HER-3 HER-4 Hétérodimères Ras-GTP Ras-GDP Raf-1 Erk-2 Erk-1 Shc Grb2 Sos K 1/ Voie Ras/Raf/mitogen-activated protein kinase (MAPK) Erk = MAPK Facteurs de transcription Prolifération

Ras-GDP Ras-GTP 2/ Voie Phosphatidylinositol 3-kinase/Akt K HER-1 (EGFR) Homodimères HER-2 HER-3 HER-4 Hétérodimères Gab-1 PI3K Ras-GTP Ras-GDP Raf-1 Erk-2 Erk-1 Shc Grb2 Sos K Akt 2/ Voie Phosphatidylinositol 3-kinase/Akt Facteurs de transcription Prolifération Survie

R-TK (HER/IGF-R) Akt Acides Aminés PI 3-kinase PIP 3 PTEN PDK - T308 mTOR Cycle cellulaire - cyclin D1 - P27kip-1 P70 S6K 4E-BP1 eIF4G, eIF4B Recrutement des Ribosomes & Traduction des Protéines Raptor PI 3-kinase PIP 3 PTEN PDK Akt - T308 - S473 FKHR GSK3b BAD IKKa Survie cellulaire Apoptose

Ras-GDP Ras-GTP 3/ Voie Phospholipase Cγ K HER-1 (EGFR) Homodimères Hétérodimères PLCγ IP3 DAG PKC Gab-1 PI3K Ras-GTP Ras-GDP Raf-1 Erk-2 Erk-1 Shc Grb2 Sos K Akt 3/ Voie Phospholipase Cγ Facteurs de transcription Prolifération Survie

Ras-GDP Ras-GTP 4/ Voie STAT HER-1 (EGFR) Homodimères HER-2 HER-3 HER-4 Hétérodimères PKC DAG PLCγ Gab-1 IP3 PI3K Ras-GTP Ras-GDP Raf-1 Erk-2 Erk-1 Shc Grb2 Sos K Akt STATs 4/ Voie STAT Signal transducers and activator of transcription Facteurs de transcription Prolifération Survie

Ras-GDP Ras-GTP Src nine-gene family of nonreceptor TK HER-1 (EGFR) Homodimères HER-2 HER-3 HER-4 Hétérodimères PKC DAG PLCγ Gab-1 IP3 PI3K Ras-GTP Ras-GDP Raf-1 Erk-2 Erk-1 Src nine-gene family of nonreceptor TK Shc Grb2 Sos K Akt STATs C-Src 5/ Voie Src kinase Adhesion Migration FAK Facteurs de transcription Prolifération Survie

Famille HER K Pas de ligand TGF alpha HB-EGF Ligand Binding Tyrosine Epi TGF alpha HB-EGF Epi HB-GF NRG1 NRG2 NRG3 NRG4 BTC BTC NRG1 NRG2 EGF Pas de ligand AR Ligand Binding K Tyrosine Kinase EGFR HER1 C-erbB HER2 C-erbB2 HER3 HER4

(Liaison avec le ligand) (Activité tyrosine kinase) R-TK: Dimérisation L’interaction avec un ligand induit une dimérisation du récepteur, élément critique pour l’initiation du signal intracellulaire. Les récepteurs dimérisés sont alors activés via à la fois une autophosphorylation ou une transphosphorylation transmoléculaire des résidus de type tyrosine kinase au niveau des domaines cytoplasmiques Domaine extracellulaire (Liaison avec le ligand) Domaine transmembrannaire Dimérisation Domaine cytoplasmique (Activité tyrosine kinase) 1 + 1 1 + 2

(Liaison avec le ligand) (Activité tyrosine kinase) R-TK: Dimérisation HER-2 qui n’apparaît pas avoir de ligand est le partenaire favori de dimérisation des autres récepteurs HER. Les hétérodimères contenant HER -2 ont des caractéristiques particulières comme une dissociation avec le ligand et une endocytose plus lentes induisant un signal d’amont plus prolongé et plus puissant permettant une prolifération cellulaire plus importante. Domaine extracellulaire (Liaison avec le ligand) Domaine transmembrannaire Dimérisation Domaine cytoplasmique (Activité tyrosine kinase) 1 + 1 1 + 2

Activation de la transduction du signal Les récepteurs TK, des cibles thérapeutiques Les mécanismes d’activation Mutation ex, EGFR; mutations au niveau de 4 exons TK, 18 – 19 – 20 - 21 pas de liaison à un ligand, mais activation constitutive du domaine kinase Modifications génomiques avec hyperexpression du récepteur Augmentation de la production de EGF ou TGF-α par les celules tumorales: création d’une boucle autocrine entrainant une activation constitutive de ErbB-1 Activation de la transduction du signal Hyperexpression HER-2 ≈ 20% Cancers du sein Boucle autocrine

Les stratégies pour inhiber ErbB 1/ Des anticorps monoclonaux dirigés vers le domaine extracellulaire du récepteur peut être utilisé pour prévenir les liaisons avec le ligand. Cette approche peut ainsi moduler la signalisation, la dimérisation ou l’expression du récepteur au niveau de la surface cellulaire aussi bien que le cytotoxicité anticorps dépendante ou faisant intervenir le complément 2/ Des petites molécules se liant au domaine kinase peuvent inhiber la phosphorylation et l’activation de la voie de signalisation en amont 1 Ac monoclonal 2 Inhibiteur de kinase 3 Antagoniste 4/ Toxine ligand

Les stratégies pour inhiber ErbB 2 Inhibiteur de kinase 1 Ac monoclonal 4/ Toxine ligand 3 Antagoniste 3/ Des antagonistes des récepteurs peuvent être utilisés en bloquant de façon compétitive la liaison avec le ligand 4/ Des ligands ou des anticorps spécifiques des récepteurs peuvent être couplés à des toxines létales. Après liaison avec le récepteur, la toxine est internalisée et tue la cellule tumorale

Les récepteurs TK, des cibles thérapeutiques Panitunumab . cetuximab HER-1 3 Antagoniste 1 Ac monoclonal 2 Inhibiteur de kinase 4/ Toxine ligand

Les récepteurs TK, des cibles thérapeutiques 3 Antagoniste 1 Ac monoclonal 2 Inhibiteur de kinase 4/ Toxine ligand trastuzumab pertuzumab HER-2

Les récepteurs TK, des cibles thérapeutiques 3 Antagoniste 1 Ac monoclonal 2 Inhibiteur de kinase 4/ Toxine ligand HER-1,2 Gefitinib Erlotinib Lapatinib …

Les récepteurs TK, des cibles thérapeutiques 3 Antagoniste 1 Ac monoclonal 2 Inhibiteur de kinase 4/ Toxine ligand TDM-1: Trastuzumab + Maytansine HER-2

La transduction du signal : les seconds messagers Une fois le récepteur trans-membranaire activé, il va s’en suivre une cascade d’évènements. Une molécule adaptatrice va se fixer sur le site phosphorylé du récepteur via un domaine d’homologie SH2. Cette molécule Shc activée va activer à son tour une protéine G intracytoplasmique. Cette protéine G va recruter une protéine « d’échange de guanine nucléotide » la protéine SOS 1 Grb2 Sos Shc PI3K Akt Ras Raf MEK1/2 MAPK BAD Survie Prolifération PTEN mTOR Progression du cycle cellulaire FKHR GSK3 p27 Cyclin D1, E

X La voie Ras/Raf/MEK/MAPK-ERK Molécules agissant sur Ras Grb2 Sos Shc PI3K Akt Ras Raf MEK1/2 MAPK BAD Survie Prolifération PTEN mTOR Progression du cycle cellulaire FKHR GSK3 p27 Cyclin D1, E X

X La voie Ras/Raf/MEK/MAPK-ERK Inhibiteurs de Raf Kinase et de MEK Grb2 Sos Shc PI3K Akt Ras Raf MEK1/2 MAPK BAD Survie Prolifération PTEN mTOR Progression du cycle cellulaire FKHR GSK3 p27 Cyclin D1, E X ISIS 5132 BAY 43-9006 PLX 4720 X CI-1040

X + La voie PI3K/PTEN/AKT/mTor Inhibition de la PI 3Kinase et restauration de PTEN Grb2 Sos Shc PI3K Akt Ras Raf MEK1/2 MAPK BAD Survie Prolifération PTEN mTOR Progression du cycle cellulaire FKHR GSK3 p27 Cyclin D1, E X +

La voie PI3K/PTEN/AKT/mTor Inhibiteurs de mTor Grb2 Sos Shc PI3K Akt Ras Raf MEK1/2 MAPK BAD Survie Prolifération PTEN mTOR Progression du cycle cellulaire FKHR GSK3 p27 Cyclin D1, E X Temsirolimus Everolimus

4/ Les inhibiteurs du cycle cellulaire Grb2 Sos Shc PI3K Akt Ras Raf MEK1/2 MAPK BAD Survie Prolifération PTEN mTOR Progression du cycle cellulaire FKHR GSK3 p27 Cyclin D1, E PTEN X Flavopiridol UCN-01 E7070

mutation exon 9 or secondary mutations Tumor Type Driven Genomic Pathway Biomarker Rationale Therapeutic Response Advanced disease Biomarker of Resistance Breast HER2 (15-20%) Trastuzumab* Trastuzumab + CT1 ? Ongoing Lapatinib* Pertuzumab Neratinib T-DM1 GIST c-Kit (CD117) mutation exon 11 Imatinib* Yes1 c-Kit mutation exon 9 or secondary mutations exons 13-14 mutation exon 17 PDGFRA D842V mutation Imatinib 800 mg or sunitinib* Nilotinib CP-868,596 Melanoma BRAF V600E Mutation (50%) PLX4720 NRas mutation MAP3K mutation COT upregulation ERK inhib. *AMM 1publication (PubMed) Italique (AACR 2011)

Advanced Basal Cell Carcinoma BCC Tumor Type Driven Genomic Pathway Biomarker Rationale Therapeutic Response Advanced disease Biomarker of Resistance Colon Kras Wild-Type Cetuximab* Yes1 BRAF mutation Lung Adenocarcinoma Mutations activ. EGFR (15%) exons 19 & 21 EML4/ALK fusion (5%) Gefitinib* Crizotinib EGFR mutation T790 ALK mutations L1196M & C11564 BIBW-2992 PF 00299804 WZ 4002 X-396 HSP90 inh. sqamous cell DDR2 mutation FGFR1 amplification (20%) Dasatinib (Src inh.) FGFR inbh. Advanced Basal Cell Carcinoma BCC PITCH/SMO mutation GDC-0449* Hedgehog inhib. *AMM 1publication (PubMed) Italique (AACR 2011)

En pratique: Cible inconnue par de biomarker (ex sunitinib, sorafenib) 2. Cible connue et hyperexprimée (HER2) 3. Cible mutante et sensible au médicament (Braf, EGFR) 4. Cible connue mutation en aval (Kras)

L ’angiogénèse tumorale: un processus complexe (1) Incluant plusieurs étapes successives 1/ Production de facteurs de croissance angiogénique 2/ Activation des cellules endothéliales par ces facteurs 3/ Hyperperméabilité des vaisseaux sanguins 4/ Dégradation des membranes basales et invasion par les cellules endothéliales 5/ Prolifération des cellules endothéliales 6/ Stabilisation des nouveaux vaisseaux sanguins via la migration des péricytes 7/ Croissance tumorale et métastases

L ’angiogénèse tumorale: un processus complexe (2) Chaque étape fournit une opportunité pour une intervention thérapeutique

3 1 2 Facteurs impliqués dans la promotion de l'Angiogénèse Tumorale Cellules Stromales Stress métabolique Stress mécanique Inflammation Altération génique Cellules Tumorales 2 PDGF bFGF Cellules Endothéliales 1 TGFa Globules Rouges Péricytes Vaisseaux Sanguins

MODULATEURS DE L’EXPRESSION DE VEGF TGF Il1β, Il6 PGE2 COX2 EGF FGF IGF PDGF P53 VHL VEGF Angiogenèse + Ras Raf Stress oxydatif Hypoxie HIF-1 MODULATEURS DE L’EXPRESSION DE VEGF - Heat shock Inducing Factor

Neutralisation des facteurs angiogèniques Inhibition VEGF et VEGF-R

Transduction du signal activée par VEGF VEGF Trap bevacizumab Cellules Stromales Cellules Tumorales Prolifération Différentiation Dégradation enzymatique Survie Migration Facteurs de transcription Protéases Protéines de structure Métabolisme enzymatique Angiogénèse Cellules Endothéliales

AVASTIN™ (AC RECOMBINANT HUMANISÉ ANTI VEGF) 93% humain, 7% murin Reconnait tous les isoformes du VEGF Kd = 8 x 10-10 M Demi-vie 17-21 jours

Inhibiteur de l’activité TK intra cellulaire : VEGFR

Inhibition spécifique de l'activité de VEGFR's Anti-VEGF Cellules Stromales RTK VEGFR Inhibiteurs SU5416 Vatanalib AGO13736 AGO28262 GW786034 (VEGR1-2-3) IMC-1121B VEGFR1 IMC-18F1 VEGFR2 IMC-3C5 VEGFR3 Ac Anti-VEGFR Cellules Tumorales Inhibiteurs de la transduction du signal Prolifération Différentiation Dégradation enzymatique Survie Migration Facteurs de transcription Protéases Protéines de structure Métabolisme enzymatique Angiogénèse Cellules Endothéliales

Inhibition de plusieurs facteurs de croissance RTK C-kit, autres kinases…. Cellules Tumorales Exemple; Sunitinib …. RTK Inhibiteurs à large spectre Péricytes Cellules Endothéliales FGFR Inh VEGFR Inh PDGFR Inh

2. Profil de tolérance

3. La thérapie génique dans le glioblastome

Introduction BUT: insérer un gène dans la cellule malade dans le but de reverser le phénotype

Distribution of gene-transfer clinical protocols approved by or submitted to regulatory authorities in North America and Europe --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Disease Number Vector Number of of protocols protocols --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Cancer 216 Retrov 159 Infectious diseases 24 Ad 58 Monogenic diseases 49 AAV 4 Cardivascular diseases 8 Poxviruses 19 Rheumatoid arthritis 2 HSV 1 Cubital tunnel syndrome 1 Naked DNA 16 ---------------------------------------- Total 300 Lipids 40 ---------------------------------------- In vivo transfer 144 Gene gun 1 Ex vivo transfer 156 Electroporation 1 Naked RNA 1 -------------------------------------------------------- Total 300 -------------------------------------------------------------------------------------------------------------

La thérapie génique reste une technique expérimentale Le problème majeur repose sur la capacité à transférer le gène dans la cellule cible Les resultats sont actuellement modestes.

SPECIFICITE DU CNS La barrière hémato-encéphalique Absence de promoteurs spécifiqu e des cellules gliales Necessité d’infecter toutes les cellules

Méthode d’infection Le plus performant est l’injection du traitement via une injection stéréotaxique. Adénovirus HSV (utile pour la technique du gène suicide) Retrovirus Lentivirus (HIV Like) ADN nu Liposome

3 types de mechanismes Correction d’une anomalie génique: ex induction de p53

Infection avec un virus contenant un gene suicide

Utilisation d’un virus Oncolytique

4. Immunothérapie et glioblastome Les différents types d’immunothérapie: Injection d’adjuvant un situ (Cpg) Vaccin contre un Ag de tumeur (EGFRvIII) Transfert de lc T (abandonné)

5. Thérapies ciblées en neurooncologie V Lorgis

Communication entre vaisseaux et le SNC Lu P, Werb Z : Science 2008; 322-1506-9

Hypothèse du Switch Angiogenique Brem S. Clin Neurosurg 1975

Le glioblastome est une tumeur vasculaire Brem S, Cotran R, Folkman J, JNCI, 1972

Antiangiogénique d’usage clinique Bevacizumab (Avastin™) Sunitinib (Sutent™) Sorafenib (Nexavar™) Cediranib (Recentin™ - AZD- 2171) (inhib VEGFR) Cilengitide (Inhibe integrin alphaV béta 3)

Bevacizumab- Efficacy in Clinical Trials – Metastatic Colorectal Cancer From Ferrara N, Nat Rev Drug Discovery, 2004; Hurwitz et al, NEJM, 2004

Batchelor T, Brem S, Sorensen G, ANGIOGENESIS FOUNDATION, 2008

Mécanisme d’action Folkman J, Nature Drug Discovery 6:274, 2007

Bevacizumab + Irinotecan

AVANT ET 2 MOIS APRES Courtesy Dr. Sajeel Chowdhary, Moffitt Cancer Center

Taux de réponse Outcome Drug Bev AZD2171 NABTC Targeted Enzastaurin CCNU Median PFS, wks 23 17 6-8 6 Median TTS 39 32 26 25 30.5 6-mo PFS, % 43 9 15 19 Response rate, % 28 56 NA 3 4 Bev, bevacizumab; CCNU, lomustine; GBM, glioblastoma multiforme; NA, not applicable; NABTC, North America Brain Tumor Coalition; PFS, progression-free survival; TTS, time to survival; VEGF, vascular endothelial growth factor.   With anti‑VEGF therapy, these outcomes have changed, and the 2 particular therapies that have been well studied to date include bevacizumab and AZD2171, which is also known as cediranib. The data in the red box show improvements in progression‑free survival, time to survival, 6‑month progression‑free survival, and response rates. Therefore, these outcomes are really dramatically improved with the use of anti‑VEGF therapy. Wagner SA, et al. ASCO 2008. Abstract 2021. Batchelor T, et al. AACR 2008. Abstract LB-247. Fine HA, et al. ASCO 2008. Abstract 2005.

Bevacizumab ± Irinotecan : Phase II Outcome Bev Alone (n = 85) Bev + Irinotecan (n = 82) Median OS, mos (95% CI) 9.2 (8.2-10.7) 8.7 (7.8-10.9) PFS at 6 mos, % (97.5% CI) 42.6 (29.6-55.5) 50.3 (36.8-63.9) Median PFS, mos (95% CI) 4.2 (2.9-5.8) 5.6 (4.4-6.2) ORR, % (97.5% CI) 28.2 (18.5-40.3) 37.8 (26.5-50.8) CR 1.2 2.4 PR 27.1 35.4 Median duration of response, mos (95% CI) 5.6 (3.0-5.8) 4.3 (4.2-NR) Bev, bevacizumab; CI, confidence interval; CR, complete response; GBM, glioblastoma multiforme; ORR, overall response rate; OS, overall survival; PFS, progression-free survival; PR, partial response.   This slide displays findings from a phase II study that evaluated bevacizumab vs bevacizumab plus irinotecan. Results showed that the median survival was essentially the same between the treatment arms, and 6‑month progression‑free survival favored the bevacizumab plus irinotecan arm at 50% vs 43% for the bevacizumab alone arm. The median progression‑free survival also favored the irinotecan arm. The response rate slightly favored the irinotecan arm, and the duration of response slightly favored the bevacizumab alone arm. Friedman HS, et al. J Clin Oncol. 2009;27:4733-4740.

Mécanisme de resistance

Echec du Beva 40% de non répondeurs Pour les répondeures la récurrence donne lieu à un changement de phénotype: la gliomatose diffuse

40 ans homme GBM.6.2008 IRM preop T-1 Gd.

4 Mois post-op. RTX + temo. KPS-90

MAIS apparition d’un contraste. KPS-90

6 Mois postop – Confirmation de la récurrence

Image a 2 mois de CPT-11+ bevacizumab.

A 4 mois RC en T1 gado mais anomalie en FLAIR

A 6 mois toujours RC en gado mais augmentation du FLAIR

A 10 mois de Beva: ,progression clinique et radiologique en T2 mais pas de T1 gado

Une possibilité: l’apparition d’autres proangiogénique Folkman J, Nature Drug Discovery 6:274, 2007

VEGF : facteur limitant l’invasion des gliomes Du R et al, HIF1alpha induces recruitment of BMDC to regulate tumor angiogenesis and invasion. Cancer Cell 13:206-220, 2008.

En conclusion: l’inibitiond e l’angiogénèse favorise l’invasion Du R et al: Cancer Cell 13:206-220, 2008.

The Clinical and Biological Imperative- Specific, Immediate, and Long-Term Objective “ It will, therefore, be instrumental to identify pathways that simultaneously block perivascular invasion and angiogenesis to improve current antiangiogenic therapy in GBM and potentially other tumors”. Du R et al: Cancer Cell 13:206-220, 2008.