LES ESCHERICHIA COLI PRODUCTEURS DE SHIGA-TOXINES (STEC) Dr. THEVENOT Unité de Microbiologie Alimentaire et Prévisionnelle de l’école nationale vétérinaire de Lyon.

PLAN Rappels II. Données bactériologiques III. Historique des épisodes épidémiques IV. Recherche des STEC dans les aliments V. Epidémiologie des infections

{ E.COLI : RAPPELS Escherichia coli E.coli intestinaux E.coli 173 Ag O 80 Ag K 56 Ag H Escherichia coli ~ 700.000 E.coli intestinaux E.coli extra-intestinaux Infections urinaires Méningites néonatales ETEC Toxines LT, ST UPEC EPEC eae, bfp hly pap sfa fimbriae type 1 EHEC eae, VT K1 , O1,O7, O16,O18 H7 sfa OmpA ibe 10 EIEC Invasion EAggEC afa , LT DAEC afa

DEFINITIONS Escherichia coli VTEC=STEC (stx gene) EHEC = STEC isolé des malades E. coli O157:H7, O103, O26, O111..)

PLAN Rappels II. Données bactériologiques III. Historique des épisodes épidémiques IV. Recherche des STEC dans les aliments V. Epidémiologie des infections

II. DONNEES BACTERIOLOGIQUES II.1. Classification II.2. Physiologie II.3. Facteurs de virulence

II.1. CLASSIFICATION - 1985: l’Allemand Theodor Escherich décrit pour la première fois la bactérie Escherichia coli - Son nom actuel lui est donné en 1919 par Castellani et Chalmers. Le genre Escherichia appartient à la famille des Enterobacteriaceae (isolement fréquent dans tube digestif)

II.1. CLASSIFICATION Les genres qui constituent les Enterobacteriaceae: bacilles à Gram-, aéro-anaérobies facultatifs, qui peuvent fermenter les nitrates et ne possèdent pas d’oxydase. 5 espèces du genre Escherichia: E. blattae, E. coli, E. fergusonii, E. hermanii et E. vulneris

II. DONNEES BACTERIOLOGIQUES II.1. Classification II.2. Physiologie II.3. Facteurs de virulence

CROISSANCE/SURVIE - température optimale de croissance: 37°C Milieu synthétique laboratoire majeure partie STEC montrent une température optimale de croissance à 40°C (mini:6-7°C, max: 45.5°C) - aw minimale pour E. coli O157:H7 est de 0.96

CROISSANCE/SURVIE - pH minimal de croissance: 4.5 Mais certaines souches résistent à des pH plus bas: Tolérance à l’acidité

DESTRUCTION - E. coli n’est pas considérée comme une bactérie thermorésistante: traitement thermiques efficaces vis-à-vis des Salmonelles le sont pour E. coli Thermorésistance de E. coli O157:H7 variable selon les matrices - Faible dose de rayons ionisants élimine E. coli O157:H7

II. DONNEES BACTERIOLOGIQUES II.1. Classification II.2. Physiologie II.3. Facteurs de virulence

II.3. FACTEURS DE VIRULENCE Adhérence à la muqueuse digestive Production de verotoxine ou shigatoxine Autres facteurs de pathogénicité

Lésions d ’attachement et d’effacement (Knutton et al, Infect. Immun. 1987) gène eae ( LEE sur îlot de pathogénicité PAI III) Production de verotoxines = shigatoxines ( gène stx)

Piédestal

FACTEURS DE VIRULENCE Adhérence à la muqueuse digestive Production de verotoxine ou shigatoxine Autres facteurs de pathogénicité

Productions de verotoxines ou Shiga like toxines Exotoxines protéiques Effet cytopathogène sur cellules Vero, HeLa Synthèse codée par des phages tempérés (transfert horizontal du gène stx de Shigella dysenteriae type 1 vers E. coli par des bactériophages… passage vers d’autres coliformes)

LES VEROTOXINES A 32kDa B Gb3 (globotriosyl céramide) A 32kDa B

Mécanisme d ’action de la toxine ENDOCYTOSE Pénétration dans l ’entérocyte Protéolyse Libération des fragments actifs A Mort cellulaire ARNm Inhibition de la sous unité 60S du ribosome

Infection intestinale PATHOGENIE Infection intestinale Diarrhée banale/ Colite hémorragique Passage dans le sang et transport par les PNN Stx Organes cibles

Verotoxine ou shigatoxine Nouvelle dénomination Ancienne dénomination gène protéine Toxine de Shiga stx Stx 99 % d'homologie Toxine Shiga-like de type I ou (SLT-I) ou vérotoxine 1(VT1) stx1 Stx1 55 % d'homologie SLT-II ou VT2 stx2 Stx2 Stx2c/d 90% d'homologie SLT-IIc/d ou VT2c/d stx2c/d stx 2e/f SLT-II/f ou VT2e/f Stx2e/f Autres variants décrits très récemment : stx2 g, . stx2-NV206

FACTEURS DE VIRULENCE Adhérence à la muqueuse digestive Production de verotoxine ou shigatoxine Autres facteurs de pathogénicité

AUTRES FACTEURS DE VIRULENCE Hémolysine gène ehxA Résistance à l'acidité gastrique : gène rpoS codant pour un facteur permettant la survie du germe à un pH <2,5 Serine protéase (EspP) plasmidique : clivage du facteur V Enterotoxine thermostable EAST1: diarrhée aqueuse Catalase (KatP) plasmidique : burst oxydatif des PNN et des macrophages saa :STEC agglutinating adhesin

Gènes codant les facteurs de virulence Chromosome Système de sécrétion de type III Tir eae Protéines espA, espB, espD stx1 stx2 LEE espP KatP ehx Plasmide 90 Kb

Crampes abdominales, diarrhée non sanglante Complications tardives Ingestion de EHEC 3- 4 jours 10% Crampes abdominales, diarrhée non sanglante Résolution 90% Diarrhée sanglante 90% Résolution 7 jours 10% SHU 5% décès ~ 30% Protéinurie ~ 60% Résolution 5% IRC ? Complications tardives Heuvelink,2000

PLAN Rappels II. Données bactériologiques III. Historique des épisodes épidémiques IV. Recherche des STEC dans les aliments V. Epidémiologie des infections

III. HISTORIQUE DES EPIDEMIES III.2. Epidémies majeures III.3. En France

Escherichia coli O157:H7 Première description en 1982 Epidémies de colites hémorragiques (USA) (Riley et al. N.Engl J Med, 1983 ) 1983 : SHU typique et E. coli O157 (Karmali et al. Lancet, 1983) Cas sporadiques et d’épidémies de diarrhées souvent sanglantes Evolution vers des pathologies plus graves : Syndrome hémolytique et urémique (SHU) Purpura thrombotique thrombocytopénique Pays industrialisés, surtout Etats Unis

III. HISTORIQUE DES EPIDEMIES III.2. Epidémies majeures III.3. En France

X ? X ? X X » ? X X X » Eau du robinet Boeuf d'élevage Jus de pomme Ecosse, 1996 400 cas 18 décès X ? X ? X X 1993 700 cas 55 SHU 4 décès X » ? SAKAI 1996 X X X 9000 cas 100 SHU 9 décès USA 1982-1999 236 épidémies 195 documentées Alimentation 66% Interhumaine 20% Eau de boisson 8% Jeux d ’eau 4 % Contact/ animal 2% » Eau du robinet Boeuf d'élevage Jus de pomme Baignade dans un lac Hamburger Hamburger X Personne à personne Pomme de terre crue Pomme de terre crue ? Inconnu Lait cru Lait cru

Incidence des infections à EHEC France 2002 : incidence du SHU pédiatrique 0,6 /105 depuis 1996, stable < 1 /105 (en moy 0,7 /105 ) Europe infections à EHEC faible en Europe continentale : < 1 /105 plus élevée au Royaume-Uni : 1,7 à 4,1 /105 SHU pédiatrique : 0,3 à 0, 7 /105 Amérique du Nord infections à EHEC : 0,6 à 5,5 /105 SHU pédiatrique : 0,7 /105

Modes et voies de transmission des infections à EHEC (données USA 1982-2002) Rangel et al. 2005 Transmission alimentaire (52%) : aliments contaminés (produits carnés (41%), produits laitiers, légumes crus …) Transmission hydrique (9%) : eau contaminée par des déjections animales (réseau ou baignade) Transmission inter-humaine (14%) Contact avec des animaux de ferme ou leur environnement (3%) Labo (0,3%) Non connus (21%)

Accidents alimentaires et aliments responsables 1) Viande de bœuf : « hamburger », 1993 Washington 2) Lait cru et/ou fromage au lait cru 3) Cidre artisanal de pommes, 1991 Massachussetts 4) Produits végétaux : salades, pommes de terre, pousses de radis (Japon 1996) 5) Eau : 1990 Missouri (effet de la chloration) Prédominance du sérotype O157:H7 par rapport aux autres sérogroupes (O111, O26, O103)

III. HISTORIQUE DES EPIDEMIES III.2. Epidémies majeures III.3. En France

Surveillance des infections à STEC chez l’homme en France Absence de recherche de STEC en routine Surveillance de SHU depuis 1996 chez les enfants de moins de 15 ans 30 services de néphro-pédiatrie CHU- CHG répartis sur toute la France, volontaires données cliniques, épidémiologiques et biologiques diagnostic d’infection à STEC : sérologie/microbio

Épidémies d’infections à EHEC en France Détection de cas groupés : de SHU par les néphro-pédiatres de SHU + cas de diarrhée : TIAC (MDO) 5 TIAC 2000 : E. coli O157 avec des merguez peu cuites (1 SHU et 10 cas de diarrhée) 2002 : E. coli O148 avec du mouton peu cuit (2 SHU et 9 cas de diarrhée) 2004 : E. coli O157:H7 fromage au lait cru de chèvre (4 malades, 2 SHU) 2005 : 2 épidémies !!!!!

PLAN Rappels II. Données bactériologiques III. Historique des épisodes épidémies IV. Recherche des STEC dans les aliments V. Epidémiologie des infections

Multiplication bactérienne non nécessaire, contamination suffisante!!! DOSES INFECTIEUSES TRES BASSES QUELQUES BACTERIES /25 g Multiplication bactérienne non nécessaire, contamination suffisante!!!

E. Coli O157:H7

Une méthode validée AFNOR en France et une norme ISO Séparation Immunomagnétique (Dynabeads. Dynal) Norme ISO EN 16654 Méthode VIDASTM (bioMérieux)

VIDAS (AFNOR)

VIDAS ICE STRIP

IMS (ISO)

Les différentes étapes de la séparation immuno-magnetique Jour 0 : 1- Enrichissement 2- Immuno-capture 3 - Séparation 4- Suspension 5- Isolement Jour 1 : 6-Confirmation

(microscopie électronique) Bactéries E. coli O157 et billes magnétiques (microscopie électronique)

Utilisation des caractéristiques biochimiques de E Utilisation des caractéristiques biochimiques de E. coli O157:H7 (Mutants!) sorbitol – b-glucuronidase – rhamnose – Résistance intermédiaire au céfixime et au tellurite

Milieu CT-SMAC Milieu CHROM agar Milieu O157:H7 ID (bioMérieux)

AUTRES STEC

METHODES DE DETECTION DES STEC non O157 AUCUNE CARACTERISTIQUE BIOCHIMIQUE COMMUNE !!!!! Pas de gélose chromogène

METHODE Détection par PCR des gènes stx après enrichissement Souches de STEC retrouvées après hybridation stx à partir des bouillons stx positifs, puis sérotypage et caractérisation génétique des isolats

LA PCR

Matériels de biologie moléculaire

Électrophorèse en gel d’agarose de fragments A B C D E F G H I eae A EHEC plasmid stx 2 stx 1 uid A eae EHEC plasmid

RECOMMANDATIONS DE L’AFSSA (28 Novembre 2001) Détection of E. coli O157:H7 et des autres sérotypes O26, O103 et O111 avec les méthodes validées AFNOR existantes, à partir des fromages au lait cru et de la viande hachée de bœuf. La recherche du gène stx par PCR pour le contrôle de la contamination des aliments par des STEC n’est pas une approche pertinente : Gène stx fréquemment détecté dans les aliments Définition d’une souche STEC pathogène non encore établie PCR non réalisée en routine dans les laboratoires de diagnostic agro-alimentaire

Pour les STEC non O157 : pas de méthodes validées AFNOR !!!! Réflexion en cours (bioMérieux, certains industriels..) Grande volonté des industriels de l’agro-alimentaire de maîtriser et de détecter ces pathogènes émergents Nombreux programme de recherche en cours

Mise au point de méthodes de détection répondant aux exigences des industriels de l’agro-alimentaire En cours !!!

Résultats du plan de surveillance 2006 de la contamination par E Résultats du plan de surveillance 2006 de la contamination par E. coli STEC dans les viandes hachées réfrigérées

796 échantillons analysés

% et [intervalle de confiance à 95%] Souches d’E. coli STEC isolées Récapitulatif des résultats obtenus: Nombre Négatif Positif % et [intervalle de confiance à 95%] Résultat PCR stx 739 (92.8%) 57 7.2% [5.4-9.3] Souches d’E. coli STEC isolées 45 12 1.5% [0.8-2.6] Souches d’E. coli STEC appartenant aux sérogroupes O157, O26, O103, O111, O145 0% [0.0-0.5]

Récapitulatif des résultats obtenus: Gènes de virulence Nombre de souches stx1 2 stx2 4 eae 1 stx1 + stx2 stx2 + eae stx2 + hly stx1 + stx2 + hly Total 12

PLAN Rappels II. Données bactériologiques III. Historique des épisodes épidémies IV. Recherche des STEC dans les aliments V. Epidémiologie des infections

SOURCE/RESERVOIR Portage sain

La coupable !!

FECES, FUMIER, BOUES D ’EPANDAGE DE STATION D ’EPURATION CYCLE EPIDEMIOLOGIQUE DENREES ALIMENTAIRES Contenu fécal RESERVOIR ANIMAL (surtout bovin) HOMME Abattoir : - carcasses : viandes découpées - hachées Traite : - lait cru, fromage au lait cru Récolte : - fruits et végétaux - denrées en contact EAU FECES, FUMIER, BOUES D ’EPANDAGE DE STATION D ’EPURATION ALIMENTS POUR BETAIL : (herbe, ensilage) Contamination oiseaux insectes

CONTAMINATION Parfentes Ligature rectum

Dépouillement pattes postérieures CONTAMINATION Dépouillement pattes postérieures Section tarses

CONTAMINATION Dépouillement Elimination du cuir

CONTAMINATION Fente sternum

CONTAMINATION Eviscération pelvienne Eviscération Abdominale

MULTIPLICATION Rupture de la chaine du froid

PROPHYLAXIE Hygiène générale en cours de fabrication Eviter les contaminations fécales!! Pas de critères microbiologiques Bactéries indicatrices d’hygiène Détection du pathogène (définition d’un plan d’échantillonnage, d’un stade de prélèvement,pool de prises d’essai..)

Merci Pour votre Attention