Le Transcriptome Introduction Méthodes d’analyse du transcriptome Puces à ADN : principe et méthodologie PCR en temps réel

Vérification et validation des résultats microarrays Apport de la PCR en temps réel

Intérêt de la PCR quantitative en temps réel : Rappel de l ’équation de la PCR N = N0 ( 1 + E )n Avec N0 : la quantité initiale de cible d’ADN E : efficacité de la PCR (E =1 dans le meilleur des mondes) n : le nombre de cycles d ’amplification N : la quantité de produit de PCR

PCR quantitative: permet une mesure directe de la réaction au cours de l ’amplification N = N0 ( 1 + E )n théorie Log ADN cible expérimental Effet Plateau Dénaturation TAQ PPi inhibiteur Compétition/ réhybridation N0 n Nombres de cycles

Domaine de quantification en PCR classique Echantillon A Log ADN cible Echantillon B PCR temps réel Nombres de cycles

Log ADN cible Nombres de cycles Echantillon A Echantillon B Seuil de détection (Threshold) Ligne de base Ct A Ct B Nombres de cycles Cuting Threshold = Ct

Amplification du même échantillon distribué dans une microplaque de 96 puits Entrée simultanée en phase linéaire (Ct identiques) Quantités finales de fluorescence sont très différentes

Ct est corrélé au nombre de copies initiales d ’ADN cible Si on a 2 fois plus d’ADN initial , le Ct est inférieur d’un cycle (si E=1) Il existe une relation linéaire entre le log du nombre de copies initiales et le cycle seuil sur au moins 6 logs Il y avait 256 fois plus de cibles dans l’échantillon B9 que dans B8 (Si E=1) B9 B8 ΔCt=8

Amplification du gène de la beta-actine (dilutions en séries avec un facteur 2)

Le Ct permet de déterminer le nombre de copies initiales

A Quoi ça ressemble ? iCycler iQ

Les systèmes de détection les plus courants Agent intercalant comme le bromure d’éthidium: le Sybergreen. Les sondes Taqman

Les systèmes de détection les plus courants Agent intercalant comme le bromure d’éthidium: le SyberGreen. Les sondes Taqman

UV Elongation Mesure: à la fin de l’étape d’élongation SB SB SB Taq SB 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ SB SB 3’ Taq 5’ SB 5’ SB SB SB 5’ Taq 3’ Elongation UV SB Taq 3’ SB SB SB 5’ 5’ SB SB 5’ Taq SB 3’ SB Mesure: à la fin de l’étape d’élongation

Identification des produits non spécifiques: - primers-dimers Vérification de la spécificité des amplifiats: utilisation des courbes de fusion Pourquoi? En SB, tous les fragments d’ADN doubles brins générés, spécifiques ou non, donneront un signal Programmer une courbe de fusion: 1 cycle avec une augmentation lente de la température pour permettre le passage de la totalité de l ’ADNds en ADNss Cette température, Tm, est caractéristique de l ’ADN et renseigne sur la séquence de l ’ADN sans directement le séquencer Pour cela on exploite le fait que le SYBR Green fluoresce environ 250 fois plus quand il est lié au double brin d ’ADN. Quand la température augmente, les doubles brins disparaissent et la fluorescence diminue. Identification des produits non spécifiques: - primers-dimers - amplicons non spécifiques

Exemple de courbe de fusion Vous pouvez suivre en direct la diminution de la fluorescence quand la température augmente (Real Time!)

Courbes de fusion: utilisation de la dérivée (-dF/dT) Tm Deux Tm indiquent la présence d’au moins deux fragments d’ADN ( le + souvent Tm1= dimères de primers) Tm1 Tm2

Les systèmes de détection les plus courants Agent intercalant comme le bromure d’éthidium: le Sybergreen. Les sondes Taqman

Sonde TaqMan Principe: Lors de la PCR, 3 oligonucléotides simples brins sont ajoutés au milieu réactionnel Les deux amorces permettant l’amplification (amorce directe et amorce inverse complémentaire Une sonde qui peut s’hybrider sur une séquence correspondant au produit de PCR amplifié (spécificité!!) La sonde contient deux fluorophores: un reporter qui est excité par le laser, et un quencher dont la longueur d’onde d’excitation correspond à la longueur d’onde d’émission du reporter. Lorsque les deux fluorophores sont à proximité, le quencher absorbe la fluorescence du reporter. 570 nm 488 nm 520 nm Reporter Quencher Fluorescéine ou FAM 5 ’ 3 ’ TAMRA

Mesure à la fin de l’étape d’élongation Pendant la PCR, la sonde s’hybride sur l’ADN simple brin lors de l’étape d’hybridation des amorces 488 nm 570 nm FAM Hybridation TAMRA 5’ 3’ 3’ 5’ 488 nm 570 nm Taq: ADN polymérase 5’-3’ et Activité Exonucléase 5’-3’ Elongation 5’ 3’ 488 nm 520 nm Mesure à la fin de l’étape d’élongation 5’

Choix du quencher Fluorophores: Quenchers: FAM TET, VIC HEX JOE CY3 TAMRA CY3.5, Redmond Red Texas Red, ROX CY5 LC640 CY5.5 LC705 BHQ-3 BHQ-2 BHQ-1 QSY-7 TAMRA Eclipse DABCYL