TOMUDEX® Raltitrexed Terence BEGHYN François BLONDEEL Julie DUMONT Etude de cas d ’un inhibiteur de la Thymidilate synthase Terence BEGHYN François BLONDEEL Julie DUMONT

Raltitrexed-TOMUDEX -Le cancer colorectal est le deuxième cancer le plus fréquent dans les pays occidentaux. -Sur les 20 0000 patients ayant un cancer du côlon chaque année en France, la moitié présentera une tumeur localement avancée ou des métastases. -Les métastases ne sont pas accessibles d’emblée par une chirurgie curative. -Tous ces patients vont donc être traités par chimiothérapie. -Depuis une dizaine d’années, beaucoup de progrès ont été réalisés dans la stratégie thérapeutique suivante: • Amélioration du mode d’administration des drogues anciennes. • Avènement de nouvelles drogues, exemple: Raltitrexed TOMUDEX®.

Stratégie Le Raltitrexed est un agent antitumoral exerçant une activité cytotoxique sur la cellule en inhibant spécifiquement la thymidilate synthase. La thymidilate synthase est une enzyme essentielle dans la vie cellulaire. Elle participe à l’élaboration de l’ADN en transformant le dUMP en dTMP. Elle possède comme cofacteur indispensable , un dérivé de l’acide folique, le méthylène THF (TétraHydro Folate), entrant dans un cycle de régénération faisant intervenir la DHFR (DiHydro Folate Réductase).

5FU RALTITREXED FdUMP dUMP TMP DNA 5,10 methylene tetrahydrofolate Thymidilate synthase De novo pyrimidine synthésis dUMP TMP DNA 5,10 methylene tetrahydrofolate Tetrahydrofolate Dihydrofolate Dihydrofolate reductase Methotrexate

Thymidilate synthase DHF Méthylène THF dTMP THF dUMP DHFR O dUMP O dTMP H N H N H H O O N N P O P O O O Thymidilate HO HO synthase H H H N N N 2 H N N N 2 DHF Méthylène THF H H N H N N N O N O H N H H R R NADPH + H + Glycine THF DHFR Sérine hydroxymethyl transférase H H N N N NADP 2 H Sérine H N N H O H N R

Ce cofacteur devient alors une cible intéressante pour l’inhibition directe de la thymidilate synthase. En effet la synthèse d’un antimétabolite capable d’occuper la place du méthylèneTHF inhiberait la TS et empêcherait ainsi la synthèse de TMP et donc d’ADN. Le méthotrexate déjà dans le commerce depuis longtemps est basé sur ce principe, mais lui est ciblé sur la DHFR. Les chercheurs ont alors tenté de synthétiser des analogues structuraux de l’acide folique et ont testé l’affinité de ces composés sur la thymidilate synthase et sur des cellules murines L1210 ayant comme caractéristique de synthétiser d ’avantage de TS.

Mise au point Premier inhibiteur potentiel de la thymidilate synthase : acide N-[4-[N-[(2-amino-3,4-dihydro-4-oxo-6-quinazolinyl)methyl]-N-prop-2-ynylamino] benzoyl]-L-glutamique CI 50=0.02 M pour l’inhibition de la thymidilate synthase(TS). CI 50=3.40 M pour l’inhibition de croissance des cellules L-1210 en culture. peu soluble dans l’eau. cytotoxicité élevée : hepatotoxicité + nephrotoxicité.

On a donc synthétisé de nouvelles molécules substituées en C2 ayant une bonne affinité sur l’enzyme mais donc la toxicité rénale et hépatique était réduite : X= CH3 : CI 50=0.04 M pour l’inhibition de la TS. CI 50=0.09 M pour l’inhibition de croissance des cellules L1210 en culture. 50 fois plus soluble que le composé précédent. Toxicité réduite corrélation solubilité/cytotoxicité X= CH2OH CI 50=0.10M CI 50=5.00M X= CF3 CI 50=5.70M CI 50100M X= C2H5 CI 50=0.14M CI 50=2.50M X= CH2NHCOCH3 CI 50=.048M CI 50=125M

Ces molécules ont montré des CI 50 nettement supérieures à celles de la molécule précédente. Le remplacement du groupement aminé en C2 par une variété de petits substituants lipophiles a donné des composants plus cytotoxiques et plus solubles. Le composé substitué par -CH3 ayant donné les meilleurs résultats ,on a gardé cette partie et on a alors essayé de substituer le noyau aromatique : R=H CI 50=0.04M CI 50=0.09M R=F a donné les meilleurs résultats : CI 50=0.02M pour l’inhibition de la TS. CI 50=0.027M pour l’inhibition de croissance des cellules L-1210 en culture.

On a également essayé de modifier le cycle aromatique ainsi que les substituants sur le N10 pour la synthèse de nouvelles molécules : R= CH3 Ar= thiazole CI 50= 0,42M CI 50= 0,006M R= CH2CCH Ar= thiazole CI 50= 0,23M CI 50= 0,008M R= (CH2)2F Ar= thiophène CI 50= 0,55M CI 50= 0,10M

Les meilleurs résultats ont été obtenus avec R = CH3 et Ar = thiophène CI 50 = 0.67M pour l’inhibition de la TS. CI 50 = 0.007 M pour l’inhibition de croissance des cellules L-1210. Ce résultat intéressant s’explique par le fait qu’elle utilise le transporteur de l’acide folique réduit pour entrer dans la cellule et est un très bon substrat pour la polyglutamate synthétase.

La modification du pont entre le C9,N10 a également été envisagée tout en changeant le substituant sur le N10 ainsi que le noyau aromatique: R’= CH2CH2F Ar = 2,5-pyridine R’= CH2CH2OH Ar = thiazole R’= CH3, Ar = thiophène a donné les résultats les moins décevants : CI 50 = 3.82M pour l’inhibition de la TS. CI 50 = 0.3M pour l’inhibition de la croissance des cellules L-1210 en culture. Étant donné leur faible affinité pour la TS, ces modifications n’ont pas été retenues.

Ce candidat portera la Dénomination Commune Internationale: Tous les résultats de ces recherches ont permis de désigner le meilleur candidat médicament ayant la plus grande affinité pour la TS tout en étant le moins toxique possible pour le foie et le rein: Ce candidat portera la Dénomination Commune Internationale: RALTITREXED On remarquera la configuration L de l ’acide aminé. En effet Zeneca a déposé un brevet sur les quinazolines faisant mention de la nécessité d ’une configuration L de la chaîne d ’acide glutamique pour une spécificité d ’action sur la thymidilate synthase. A la suite de cette recherche aboutissant au brevet, il n ’a pas été envisagé de travailler avec des D acides aminés. (brevet n° WO 93/19051)

J. Med. Chem. 1991, 34, 2209-2218

entre l’acide folique et le Raltitrexed Mode d'action Analogie de structure entre l’acide folique et le Raltitrexed p-aminobenzoïque acid (PABA) Pteridine Résidus glutamyl Acide folique H N N N O C O O H 2 ( ) O H N N N N H O n O C O O H H N N ( ) 2 O H N H N N S H O n O Polyglutamatation O C O O H H N 2 Raltitrexed O H N N S H O O

Acides aminés essentiels dans les liaisons du Raltitrexed à la thymidilate synthase. Par des études de cristallographie on a pu déterminer les acides aminés essentiels dans la liaison de l’acide folique à la TS. Puis par des mutations ponctuelles de ces AA, et par comparaison des IC50 de plusieurs inhibiteurs de la TS en cours d’étude (comme le raltitrexed = ZD1694), des chercheurs ont pu mettre en évidence les deux principaux AA qui interviennent dans les liaisons hydrophobes, entre ZD1694 et TS. Ils sont arrivés à la conclusion que les AA Phe225 et Ile108 étaient responsables des interactions hydrophobes avec la partie PABA (para amino benzoïc acid) ici remplacé par un thiophène dans le raltitrexed.

THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY (Vol 273, n°47 p31209-31214, 1998) Phé225 Ile108 Leu221 ANTIFOLATE Met311 Trp109

Pharmacocinétique Après administration IV d’une dose de 3mg/m 2 la pharmacocinétique est triphasique. La concentration maximale est atteinte au bout de 15 min (93% fixés aux protéines plasmatiques), suivie dans un premier temps d’une diminution rapide du taux sérique qui correspond à une entrée dans les cellules de l’organisme, puis une élimination lente due à la rétention dans les cellules après polyglutamatation. Cmax=656 ng/ml 1/2 vie=198h Elimination fécale et surtout rénale Pas de rétention ou d’accumulation à usage normal toutes les 3 semaines.

Mode de pénétration dans les cellules de l’organisme. 37 antifolates inhibiteurs de croissance cellulaire ont été comparés in vitro sur des cellules humaines et murines, en faisant varier l’expression de deux transporteurs : Le transporteur de folate réduit RFC et le transporteur de folate associé à la membrane mFBP. RFC : Le ZD1694 a une bonne affinité pour ce transporteur. Le RFC participe à l’entrée du raltitrexed dans la cellule. mFBP : Le mFBP est aussi capable de reconnaître le ZD1694 avec une bonne affinité, il a même été montré que c’était le transporteur principal.

MOLECULAR PHARMACOLOGY, 48:459-471 (1995)

MOLECULAR PHARMACOLOGY, 48:459-471 (1995)

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Reduced folate-methotrexate Raltitrexed extracellular Thymidine Cell membrane Reduced folate-methotrexate cell membrane carrier Nucleoside transport protéine Intracellular Raltitrexed Thymidine Thymidine kinase Folyopolyglutamate synthétase dTMP dTTP DNA Inhibition Thymidilate synthase Ral-Glu3-5 dUMP

Polyglutamatation et conséquences : On sait que les antifoliques sont de bons substrats pour la FPGS (Folyl polyglutamate synthétase).En effet les molécules de ce type sont polyglutamatés dès leur entrée dans la cellule. Il a été montré que cette augmentation de charge négative (-COO- ) permettait une meilleure rétention dans la cellule et surtout augmenté considérablement l’activité des dérivés polyglutamatés, par rapport à ceux monoglutamatés, sur la thymidilate synthase. Ceci permet d’expliquer la lente élimination du raltitrexed par l’organisme mais aussi les effets indésirables.

MOLECULAR PHARMACOLOGY, 48:459-471 (1995)

Utilisations thérapeutiques Intérêt du Raltitrexed dans la stratégie thérapeutique: -faut-t-il traiter les patients ayant un cancer du colon avancé? oui, deux études le prouvent: ~1992 : comparaison des effets de la chimiothérapie par 5FU/methotrexate sur deux lots de patients différents, 1°lot : traitement dès que le diagnostic de métastases est connu. 2°lot : traitement à l’apparition des symptômes. Nombre de patients inclus dans l’étude : 183. Résultats : 1°lot : différence de survie de 8 mois sans symptômes. 2°lot : différence de survie globale de 5 mois.

~1993 : comparaison de la survie de deux lots de patients: 1°lot : traitement uniquement par soins palliatifs. 2°lot : traitement par chimiothérapie par association 5FU+acide folinique+cisplatine. Nombre de patients inclus dans l’étude : 40. Résultats : la médiane de survie a plus que doublé par la chimiothérapie, 11mois versus 5 mois. Dans ces deux études, l’effet sur la survie ne s’est pas fait au détriment de la qualité de vie qui a été améliorée par le traitement. L’instauration d’une chimiothérapie immédiate améliore donc la survie et le confort de vie des patients comparée à une chimiothérapie différée à l’apparition des symptômes.

-Comparaison entre le Raltitrexed et les autres chimiothérapies: Il y a une dizaine d’années, le 5FU restait la seule drogue ayant une activité indiscutable dans la chimiothérapie des cancers du côlon avancé. Les chercheurs ont commencé par travailler sur l’amélioration du mode d’administration du 5FU. ~perfusion de 5FU en continu: permet d’augmenter le nombre de réponses mais il s’agit d’une technique coûteuse avec un impact néfaste sur le confort de vie du patient. ~association 5FU+acide folinique: résultats encourageants mais difficultés pour déterminer la dose optimale d’AF qu’il faut associer.

~association 5FU+methotrexate: moins avantageux comparé à la stratégie précédente en raison d’une plus grande toxicité et d’une moins grande facilité d’administration. ~le LV5FU2: il s’agit d’un nouveau schéma de perfusion du 5FU; il associe fortes doses d’acide folinique en perfusion courte et perfusion de 22h de 5FU. Néanmoins, la modalité d’administration reste lourde et depuis 1997, les chercheurs travaillent sur la mise en place de schémas d’administration hebdomadaires. Les premiers résultats obtenus semblent plutôt prometteurs.

Parallèlement à ce travail sur le mode d’administration du 5FU, la recherche de nouveaux médicaments a permis d’ouvrir de nouvelles perspectives dans la stratégie thérapeutique. Le Raltitrexed TOMUDEX, a obtenu l’AMM pour le traitement des cancers colorectaux avancés après les résultats d’une longue étude de phase 2 et de phase 3 comparant ce nouvel inhibiteur de la thymidilate synthétase à l’association 5FU +Leucovorine (precurseur de THF) chez 439 patients.(1996) Resultats:-19,3% de réponse pour le raltitrexed contre 16,7% pour 5FU+LV sans réelle différence de survie globale. -globalement en faveur de Raltitrexed en raison de sa grande facilité d’administration:1 injection toutes les 3 semaines. -avec le raltitrexed, diminution significative des taux de mucites (facteur 10) et des leucopénies sévères (facteur2)

Document fourni par ZENECA

L’ensemble des études comparatives semble indiquer que le taux de réponse du raltitrexed semble se situer entre 14 et 26% avec une différence moyenne de survie de 9,7 à 11,2 mois. Ces valeurs montrent que l’efficacité antitumorale du raltitrexed est presque analogue à celle de 5FU+LV. Cependant, des études ultérieures aux Etats-Unis et en Europe donnent des résultats moins favorables. Celle réalisée en Europe n’a pas mis en évidence une différence en termes de réponse ou de survie globale mais la survie sans progression semble être plus longue pour l’association 5FU + fortes doses de Leucovorine (5,1mois contre 3,9mois pour le raltitrexed). Par ailleurs, il a été mis en évidence un gain de poids plus fréquent avec la polythérapie à base de 5FU par rapport au TOMUDEX. Remarque: il a été déterminé que le coût du traitement par le raltitrexed est inférieur à celui d’un polythérapie à base de 5FU.

Document fourni par ZENECA

-efficacité du raltitrexed: Une étude de phase 2 englobant 176 patients dans un stade avancé de cancer colorectal et ayant des métastases au foie (80%) a permis de démontrer l’efficacité du raltitrexed. Dose usuelle de 3 mg/m2 en intraveineuse de 15 min toutes les 3 semaines. Les résultats sont les suivants: - nombre de patients en totale rémission: 4 -nombre de patients en rémission partielle: 41 -nombre de patients dont la pathologie s’est stabilisée:86.

-Indications, effets secondaires, contre-indications : -Traitement de la progression métastasique des cancers colo-rectaux. -Traitement du cancer du rectum.(1ère intention dans les formes métastasées) Il faut noter que lors des essais de phase 2, il a été démontré une activité sur les tumeurs solides du sein, de l’ovaire, du pancréas, de l’estomac, et certains cancers du poumon. Posologie usuelle : 3 mg/m2 en perfusion intraveineuse de 15 minutes toutes les trois semaines.

Document fourni par ZENECA

effets secondaires : -nausées, vomissements (sensibles aux antiémétiques classiques) -diarrhée. -leucopénie (légère à modérée) -anémie. -thrombopénie. -augmentation des transaminases(asymptomatique) -asthénie. -éruptions cutanées. Remarque: Ces effets indésirables sont majoritairement liés à l’inhibition de la thymidilate synthétase, ils affectent d’avantage les cellules se divisant très rapidement. Un surdosage en raltitrexed se manifestera par une accentuation des effets indésirables et pourra être traité par l’administration d’ acide folinique et de thymidine. Contre-indications:grossesse, allaitement, toxicité médullaire et digestive graves, insuffisance rénale sévère.

-Conclusions : Le raltititrexed semble tout à fait tenir sa place au sein de l’arsenal thérapeutique, puiqu’il fait partie intégrante du protocole de chimiothérapie des cancers du côlon de la Fondation Française de Cancérologie Digestive. Néanmoins depuis sa mise sur le marché en 1996,on a pu assister à l’émergence de nouvelles drogues prometteuses telles que les dérivés oraux du 5FU (tegafur,capécitabine), l’irinotécan, et l’oxaliplatine. La démonstration de l’efficacité des nouvelles drogues a été à l’origine d’une augmentation de l’agressivité thérapeutique.

Le souci actuel des thérapeutes repose sur une adaptation idéale du traitement au patient, on ne traitera pas de la même façon un patient âgé ayant plusieurs sites métastasiques inaccessibles à une chirurgie et un malade ayant des métastases hépatiques ou pulmonaires accessibles. Le second recevra une chimiothérapie privilégiant l’efficacité, en vue d’une intervention chirurgicale alors que le premier bénéficiera d’un traitement respectant au mieux sa qualité de vie.

On a ainsi pu montré les différentes étapes qui sont intervenues à la fois dans la drug discovery et dans la drug design. Cette étude de cas nous a aussi montré que le Raltitrexed n’est pas un médicament révolutionnaire mais qu’il a une place non négligeable en thérapie cancéreuse.

The END