Enseignement de M1 « Physiologie des épitheliums » 2006-2007 Enseignement de M1 « Physiologie des épitheliums » Bases structurales, Modèles animaux et physiologie Robert DUCROC Inserm Unité 773 Centre de Recherche Biomédicale Bichat-Beaujon

Importance des mouvements d’électrolytes dans l’activité fonctionnelle des cellules épithéliales digestives Méthode de la chambre de Ussing Application à un problème d’endocrinologie digestive : le contrôle du transport intestinal de glucose

Estomac: sécrétion acide Mucus, FI, pepsinogène Duodénum: sécrétion de bicarbonate et mucus Jéjunum: absorption des sucres Iléon : absorptions des acides aminés eau, électrolytes Côlon : Sécrétion de mucus Carbohydrates : butyrate, propionate..)

Hauteur des villosités Ph acide, peu de bactéries Segmentation intestinale et fonctions selon l’axe proximo-distal Duodénum (25 cm) Sécrétion bicarbonate Fe, Ca Jéjunum ( 200 cm) Sucres Côlon (180 cm) Equilibre Hydro minéral bactéries Iléon (300 cm) Cecum rongeurs fermentation Aminoacides Sphyncter pylorique Canal pancréatique Canalicule biliaire Plaques de Peyer rectum Goblet cells Hauteur des villosités Ph alkalin, flore ++ Ph acide, peu de bactéries

Organisation des tuniques Structure polarisée (cf épithélium) Repliement : augmentation de la surface d’échange Cellules Caco2

Différenciation de l’intestin selon un axe crypto-villositaire Mort cellulaire,desquamation Types cellulaires Matures : Cellules absorbantes Cellules entéro-endocrine Cellules en gobelet cellules M villosité Migration et différenciation Compartiment d’amplification crypte Cellules souches Cellules de Paneth

Facteurs impliqués dans la différenciation des cellules intestinales Cellule souche Notch Wnt (c-myc) HES1 Cellule progénitrice Math1 Cellule sécrétoire NGN3 Klf4 Elf4 Cellule de Paneth entérocyte Cellule entéro-endocrine Cellule en gobelet HNF1 Cdx2 GATA4 HNF4 BETA2 PAX4, PAX6 Pdx1 Cellule épithéliale absorptivemature 12 phénotypes distincts : G, I, K…

Transports ioniques dans les entérocytes < gradient électrochimique << Absorption de Na+ Sécrétion de Chlore Na+ ENAc H+ Na+ NHE2, NHE3 Na+ K+ Na K ATPase ~ Na+ glucose H+ Amino acides Cl CFTR sang lumière

Transports ioniques dans une cellule intestinale < gradient électrochimique << Cellule « au repos » Cellule « absorbante » H2O CO2 AC pH NHE2, Na+ H+ NHE3 Na+ K+ Na K ATPase ~ Na+ carbohydrates H+ K+ Cl- Na K 2Cl Na+ Amino acides H+ Di-peptides sang lumière

~ mouvements ioniques dans les cellules épitheliales intestinales amiloride DPC Diphenylamineacrboxylate Bumétamide ouabaine DIDS di-isothiocyanostilbene-disulfonic acid Na+ ENAc Cl- Na+ HCO3 NHE2 Na+ H+ H2O CO2 AC Na+ carbohydrates Na+ K+ Na K ATPase ~ HCO3- Cl- Échangeur Cl/Bicarbonate K+ Cl- Na K 2Cl Na+ Cl- CFTR Cl- CaCl K+ sang lumière

Solute Carrier Family , From HUGO The Human Genome Organization (HUGO) Nomenclature Committee Database includes more than 40 transporter families of the so-called SLC (solute carrier) gene ...   SLC1: The high affinity glutamate and neutral AA transporter family 7   SLC2: The facilitative GLUT transporter family 14   SLC3: The heavy subunits of the heteromeric amino acid transporters 2   SLC4: The bicarbonate transporter family 10   SLC5: The sodium glucose cotransporter family 11   SLC6: The sodium- chloride- dependent neurotransmitter transporter family 16   SLC7: The cationic amino acid transporter/glycoprotein-associated family 13   SLC8: The Na+/Ca2+ exchanger family 3   SLC9: The Na+/H+ exchanger family 9   SLC10: The sodium bile salt cotransport family 5   SLC11: The proton coupled metal ion transporter family 2   SLC12: The electroneutral cation-Cl cotransporter family 9   SLC13: The human Na+-sulfate/carboxylate cotransporter family 5   SLC14: The urea transporter family 2   SLC15: The proton oligopeptide cotransporter family 4   SLC16: The monocarboxylate transporter family 14   SLC17: The vesicular glutamate transporter family 8   SLC18: The vesicular amine transporter family 3   SLC19: The folate/thiamine transporter family 3   SLC20: The type III Na+-phosphate cotransporter family 2   SLC21/SLCO: The organic anion transporting family 20 SLC22: The organic cation/anion/zwitterion transporter family 18   SLC23: The Na+-dependent ascorbic acid transporter family 4   SLC24: The Na+/(Ca2+-K+) exchanger family 5   SLC25: The mitochondrial carrier family 29   SLC26: The multifunctional anion exchanger family 11   SLC27: The fatty acid transport protein family 6   SLC28: The Na+-coupled nucleoside transport family 3   SLC29: The facilitative nucleoside transporter family 4   SLC30: The zinc efflux family 9   SLC31: The copper transporter family 2   SLC32: The vesicular inhibitory amino acid transporter family 1   SLC33: The Acety-CoA transporter family 1   SLC34: The type II Na+-phosphate cotransporter family 3   SLC35: The nucleoside-sugar transporter family 23   SLC36: The proton-coupled amino acid transporter family 4   SLC37: The sugar-phosphate/phosphate exchanger family 4   SLC38: The System A & N, Na+-coupled neutral amino acid transporter family 6   SLC39: The metal ion transporter family 14   SLC40: The basolateral iron transporter family 1   SLC41: The MgtE-like magnesium transporter family 3   SLC42: The Rh ammonium transporter family (pending) 3   SLC43: Na+-independent, system-L like amino acid transporter family 3 Total 319 Hediger MA, Romero MF, Peng JB, Rolfs A, Takanaga H, Bruford EA. Pflugers Arch. 447(5) : 465-8, 2004;

Low glucose SGLT1 : sodium glucose transporter 1 apical membrane 3 Na+ 2 K+ ATP basolateral membrane Na+/K+-ATPase Glut2 K+channel

High glucose Glut2 SGLT1 apical membrane 3 Na+ 2 K+ basolateral ATP basolateral membrane Na+/K+-ATPase Glut2 K+channel

Low glucose ( fructose ) SGLT1 Glut5 apical membrane 3 Na+ 2 K+ ATP basolateral membrane Na+/K+-ATPase K+channel Glut2

le gradient de sodium généré par l’ATPase Na+,K+ constitue un moteur pour l’activité de plusieurs transporteurs : - Transport Na-dépendant d’hexose (glucose, galactose..) jéjunum Transport Na+-dépendant d’acides aminés (glutamine, alanine..) Ileum Transport Na+-dépendant d’acides gras à chaînes courtes (butyrate, lactate.. Côlon Ces transports ont lieu dans des segments différents du tube digestifs Ils peuvent être étudié sur le tissu isolé en suivant les mouvements de sodium

Importance des mouvements ioniques à travers l’épithélium intestinal : - les pompes constituent des moteurs pour l’entrée des nutriments les mouvements d’eau sont indispensables aux fonctions d’échanges (dilutions des enzymes, pH..) de défense (sécrétion de chlore, rinçage de la lumière.), de transit du bol alimentaire..

Na+ Glut2 ATP ase Transport intestinal des sucres Fructose Glucose fructose, glucose, galactose.. Glut 5 Fructose Glucose Fructose Glut2 fructose glucose Glucose SGLT1 K + ATP ase Na+ Na+ sang Lumière intestinale

Etudes des mouvements ioniques à travers le tissus isolé Méthode de la chambre de Ussing

un outil classique de la physiologie… La chambre de Ussing un outil classique de la physiologie… - Démonstration du caractère actif du transport (pas de gradient électrochimique) Principe = pas de forces s’exerçant sur le mouvement des ions (gradient de concentration, pH, gradient de pression, de température.. Donc seul l’activité des transporteurs est en cause = transport actif - Permet la mesure qualitative et quantitative des mouvements ioniques Ussing HH and Zerahn K. Active sodium as the source of electric current in the short circuited isolated frog skin. Acta Physiol Scand 23: 110, 1951 Schultz SG and Zalusky R. Ion transport in isolated rabbit ileum. I. : Short circuit current and Na fluxes. J Gen Physiol 47: 567, 1964

un outil classique de la physiologie… La chambre de Ussing … un outil classique de la physiologie… Démonstration du caractère actif du transport (pas de gradient électrochimique) : Mesures qualitative et quantitative des mouvements ioniques - Accès aux faces séreuse et muqueuse de l’épithélium (application pharmacologiques..) Application aux tissus, biopsies, cellules en culture sur filtre … Ussing HH and Zerahn K. Active sodium as the source of electric current in the short circuited isolated frog skin. Acta Physiol Scand 23: 110, 1951

Chambre de Ussing muqueux séreux Intestin, biopsie.. O mV Isc ddp (mV)

Mélange gazeux (carbogène) Système thermostatée Chambre 1 Chambre 2 Tissu Electrode « potentiel » Oxygénation I2 I1 V2 V1 Electrode « courant » Boitier « relai » avec le millivoltmètre et le microampéremètre

Un poste complet de mesure des courants de court-circuit.. Interface avec microordinateur Microordinateur Bain-marie Oxygène, 95% CO2, 5% Micro-voltmètre et Micro-ampèremètre réunis dans un Voltage Clamp automatique Chambres de Ussing

Low glucose SGLT1 : sodium glucose transporter 1 apical membrane 3 Na+ 2 K+ ATP basolateral membrane Na+/K+-ATPase Glut2 K+channel

du transport actif de glucose Etude de la régulation du transport actif de glucose 60 ± treatment 50 ± peptide 40 Isc (μA) 30 Carbachol, 100 µM 20 Glucose, 10 mM 40 45 50 55 60 65 time (min)

Application à l’étude de la régulation de l’absorption de glucose par des peptides La leptine luminale inhibe l’absorption active de glucose dans l’intestin Equipe de Physiologie Digestive Inserm U. 773 Centre de Recherche Biomédicale Bichat-Beaujon, CRB3 Faculté de Médecine Xavier Bichat, Paris

Leptine adipocytaire vs. leptine digestive Une protéine non glycosylée de 16KDa Produite par l’adipocyte, secrétée dans la circulation, libérée tardivement après le repas Cible principale : l’hypothalamus Fonction : contrôle de la masse adipeuse L’estomac est également une source de leptine…. Leptine adipocytaire vs. leptine digestive

Ob-R Leptine digestive Leptine digestive : Cellules gastriques, sécrétée dans la lumière digestive, augmente rapidement après le repas Ob-R J Clin Invest 2001 Leptine digestive

Na+ Na+ ? ? Glucose Leptine Leptine digestive sang lumière Ob-R Leptine digestive Leptine ? Pool intracellulaire de SGLT1 K + ATP ase Na+ Na+ SGLT1 Glut2 Glucose Glucose sang lumière

leptine leptine Chambre de Ussing Isc muqueux séreux Glucose Na+ ~

modulation du transport de glucose Na+-dependant + GLP-2 * 2 75 Δ Isc (μA/cm ) + CCK-8 + leptine (mucosal) * 50 * 25

La leptine inhibe le transport d’un sucre non métabolisé, le methyl D glucopyranoside 5 10 15 20 25 30 35 Δ Isc (μA/cm ) 2 Methyl D Gluc Leptin (10 nM) +

Quelles sont les caractéristiques de cette inhibition par la leptine luminale ?

Inhibition du transport actif de glucose dépendant de la concentration -11 -10 -9 -8 -7 20 40 60 80 100 leptin [- log M] glucose-induced Isc (%) IC50 : 0.13 nM

La leptine luminale inhibe le transport actif de glucose concentration différentes de glucose 2 Glucose induced Isc (Δ, μA/cm ) 40 35 30 25 20 15 10 5 1 10 50 Glucose (mmol/L)

La leptine luminale inhibe le transport actif de glucose action directe, récepteurs fonctionnels 2 25 Δ Isc (μA/cm ) 20 15 * 10 5 Fat (fa/fa) Lean (Fa/fa) Zucker rats

Quel est le mécanisme de l’inhibition de l’absorption de glucose par la leptine luminale ?

Na+ Na+ ? ? Glucose Leptine digestive ?? sang lumière Ob-R ?? ? Pool intracellulaire de SGLT1 K + ATP ase Na+ Na+ SGLT1 Glut2 Glucose Glucose sang lumière

La leptine luminale réduit l’abondance de SGLT-1 dans la bordure en brosse SGLT-1 β-actin 45 kd 75 kd CTRL 1 2 3 4 glucose Leptine + glucose Protéines totales 1 CTRL 2 3 4 glucose Leptine + glucose Protéines de la bordure en brosse

La leptine luminale inhibe le transport actif de glucose implication de la PKC Inhibiteur isoformes ‘nouvelles’ Inhibiteur isoformes classiques 2 50 Gö6976 Rottlenin Δ Isc (μA/cm ) 25 * * * CTRL leptine CTRL leptine

En résumé, La leptine digestive contrôle le transport actif de glucose dans la lumière de façon rapide, directe et physiologique La présence de récepteurs fonctionnel est requise Le mécanisme de l’inhibition vise la translocation de SGLT1 dans la bordure en brosse en impliquant une voie PKC dépendante (βII ?)

Quel est l’effet de la leptine administrée du côté séreux ?

Effet de la leptine après 2 minutes serosal 2 35 30 Δ Isc (μA/cm ) 25 20 15 10 5 mucosal

Cinétique de l’inhibition du transport de glucose par la leptine muqueuse vs. séreuse Glucose-induced Isc (% of controls) 100 Leptine séreuse 75 50 Leptine muqueuse 25 2 5 10 15 20 min

la CCK est sécrétée par les cellules endocrines I duodéno-jéjunales en réponse à la leptine (Guilmeau et al Diabetes 2003) Question : cet effet du coté séreux est-il dépendant de la CCK ?

?? lumière Cellule épitheliale intestinale Cellule endocrine type I Leptine (Sx) glucose Récepteur leptine lumière Cellule épitheliale intestinale ?? Récepteur CCK Cellule endocrine type I ?? Antagonistes récepteurs CCK Type 1 ou type 2 ?? Récepteur leptine Adipocyte Leptine (Sx)

- + + + + - - + - - - - - + - - - - - + antagonistes des récepteurs CCK-2 2 50 antagoniste des récepteurs CCK-1 Δ Isc (μA/cm ) 25 - + + + + Leptine - - + - - YM 022 - - - + - L 365 260 - - - - + L 364 718

Cellule épitheliale intestinale glucose Leptine (Sx) Récepteur leptine lumière Cellule épitheliale intestinale Récepteur CCK Cellule endocrine (I) Récepteur leptine Leptine (Sx)

L’effet ‘séreux’ de la leptine sur le transport de glucose apparaît indirect, médié par le récepteur CCK-2 Ceci suggère une implication de la CCK dans l’inhibition induite par la leptine. Cette action pourrait prolonger l’effet inhibiteur direct de la leptine…

Conclusion, la leptine digestive joue un rôle majeur, à la fois direct et indirect, dans le contrôle de l’absorption intestinale de glucose Cette fonction nouvelle de la leptine digestive doit être considérée dans le contexte : de l’activité de signalisation de SGLT-1 (PKC, regulatory protein RS1) - de la sécrétion de leptine par l’adipocyte du rôle important de l’intestin dans l’homéostasie du métabolisme énergétique

Cellule épitheliale intestinale lumière Cellule épitheliale intestinale Récepteur 1 Cellule endocrine (I, L, ..) Neurones entériques (CCK.. CCK Leptin etc insulin GLP-2 etc