Helicobacter pylori, inflammation chronique et cancer gastrique Hilde de Reuse (hdereuse@pasteur.fr) Unité de Pathogenèse de Helicobacter Institut Pasteur, PARIS

pH median de l’estomac = 2 Jusqu’en 1983, on pensait que l’estomac était un organe stérile et que les ulcères de l’estomac étaient causés par le stress pH median de l’estomac = 2

Anciennes observations de bactéries dans l’estomac... 1886 : identification de bactéries spiralées dans des lavages gastriques humains par Walery Jaworski (Université de Cracovie) 1893 : description de bactéries spiralées dans l’estomac d’un chien par Giulio Bizzozero (Université de Padoue)

Ces observations ne montrent pas que la bactérie cause une maladie

En 1983 - le travail exemplaire de deux médecins australiens, R En 1983 - le travail exemplaire de deux médecins australiens, R. Warren et B. Marshall 1) Analyse de biopsies de l’estomac de 135 patients souffrant de gastrite et de biopsies de patients sains => identification d’une bactérie spiralée uniquement chez les patients souffrant de gastrite 2) Culture de cette bactérie pure in vitro 3) Barry Marshall démontre l’un des postulats de Koch en avalant une culture de cette bactérie qu’ils appellent Helicobacter pylori

2005: R. Warren et B. Marshall Prix Nobel de Médecine pour la démonstration du rôle de la bactérie Helicobacter pylori dans le développement des maladies de l’estomac First, a few landmarks in the short history 1) as all of you know in 1983-84 Warren and Marshall isolated.. I cannot resist to the pleasure of showing you a picture of Marshall and Warren who got the nobel prize of this year.

La bactérie Helicobacter pylori Gram négatif Classe des epsilon protéobactéries Spiralée et fortement mobile H. pylori colonise exclusivement l’estomac des humains et des primates non-humains Helicobacter pylori : chef de file d’un nouveau genre bactérien

Helicobacter pylori chef de file d’un nouveau genre bactérien

Infections par Helicobacter pylori

très forte prévalence, la moitié de la population humaine mondiale fortes disparités géographiques (niveau socio-économique)

Epidémiologie de l’infection par Helicobacter pylori Mode de transmission : - inter-humaine - acquisition par voie oro-orale - acquisition au cours de la petite enfance - transmission le plus souvent intrafamiliale - infection persiste souvent toute la vie

Prévalence des infections à H. pylori Dans les pays occidentaux => l’incidence diminue - 66 % de la population de l’âge de 60 ans est infectée - 22 % de la population de l’âge de 20 ans est infectée Effet cohorte

Pathologies associées à l’infection par H. pylori Gastrite chronique (100%) 20-30a Asymptomatique (80%) Gastrite atrophique 30-50a Dyspepsie fonctionnelle (5-10%) Ulcères gastriques ou duodénaux (10%) Métaplasie intestinale Lymphome du MALT (0.3%) Dysplasie Adénocarcinome (1-3%) 65-80a

Facteurs de l’environnement Caractéristiques génétiques et mode de vie de l’hôte Caractéristiques génétiques de l’hôte Polymorphismes des cytokines pro-inflammatoires -> TNF et IL1 β (puissant inhibiteur de la sécrétion acide gastrique) Risque accru d'atrophie gastrique et d'adénocarcinome Génotype de la bactérie (îlot de pathogénicité Cag, VacA-s1m1)

Traitements des infections à Helicobacter pylori Trithérapie de 7 jours : combinaison de deux antibiotiques parmi (Amoxicilline, clarithromycine, tétracycline, métronidazole) + inhibiteur de Pompe à Protons (IPP) Nouveaux traitements (90% éradication) - séquentiel - IPP, Tetracycline, Metronidazole, Bismuth Apparition préoccupante de souches résistantes Souches isolées de 530 biopsies (2004-2007, France) 26% clarithromycineR 61% métronidazoleR 0% amoxicillineR (Raymond et al. Helicobacter 2010)

Helicobacter pylori et cancer gastrique 1994 : reconnaissance internationale de H. pylori comme oncogène de classe I par l’agence internationale de recherche sur le cancer (IARC)

Cancers associés aux infections Nombre total de cancers attribuables aux infections en 2002 : - 1.9 million de cas dans le monde - 18% de l’ensemble des cancers Principaux agents impliqués : Bactérie : Helicobacter pylori 5.5% Virus : Papilloma Virus humains 5.2% Virus des Hépatites B & C 4.9% Virus d’Epstein-Barr 1% VIH & HHV8 0.9% HTL Virus 0.03% Parasites du foie : 0.02% (Parkin, Int J Cancer 2006) cancers gastriques

Le cancer gastrique en chiffre 600 000 nouveaux cas/an dans le monde 2ème cause de mortalité par cancer dans le monde (2/3 des cas dans pays en voie de développement) 800 000 morts par an dans le monde En France : 6 000 nouveaux cas/an Survie à 5 ans : 10-15 % Cancers gastriques associés à H. pylori 90 % des lymphomes gastriques de type MALT 71 % des adénocarcinomes gastrique distaux (de type intestinal ou diffus)

Sur les 280 patients non-infectés par H. pylori ou infectés et traités - Suivi longitudinal sur 10 ans de 1526 patients japonais Sur les 280 patients non-infectés par H. pylori ou infectés et traités aucun n’a développé de cancer *  4,7 % Dyspeptiques 3,5 % Ulcères gastriques 2,2 % Polypes gastriques 0 % Ulcères duodénaux Sur 1246 patients infectés par H. pylori * 36 patients ont développé un cancer (2,9%) Uemura et al. N. Engl. J. Med. (2001)

Comment l’infection par H. pylori conduit au cancer gastrique ? Processus très long (>40 ans) multifactoriel - mécanismes encore mal compris. H. pylori provoque une réponse inflammatoire chronique au niveau des cellules épithéliales de la muqueuse gastrique => conduit à des lésions de l'ADN (espèces réactives de l'oxygène et de l'azote). H. pylori provoque l'augmentation de l'enzyme AID, une cytidine deaminase responsable de l"editing" d'ADN => génère l'accumulation de mutations dans TP53. (Matsumoto et al. Nature Med 2007) L'infection par H. pylori diminue l'expression de certaines enzymes de réparation de l'ADN. (Machado et al, Clin. Canc Res 2009) H. pylori exprime des facteurs de virulence dont les activités augmentent le risque d'oncogenèse (VacA et CagA).

Activités de la cytotoxine VacA Integrin ß2 Inhibition de l'activation et de la prolifération IL-2 Altération de la capacité à présenter les antigènes Activité immuno-suppressive : évasion de la réponse immunitaire adaptative Macrophages Lymphocytes B Cellules T Inhibition de la fusion phagosome-lysosome Libération cytochrome C Vacuolisation Affaiblissement des jonctions intracellulaires Induction de l'apoptose Activités de la cytotoxine VacA Domaine autotransporteur Séquence signal s i m s1 s2 i1 i2 m1 m2 Formes plus fréquemment associées avec le cancer gastrique p33 p55 (D'après Polk and Peek, Nature Reviews Cancer, 2010)

L'îlot de pathogénicité Cag cagA 30 gènes 40 kb Ilot Cag : acquis par transfert horizontal de gènes, présent dans : 50 % des souches européennes >95% des souches asiatiques souches Cag+ = facteur de risque pour le cancer gastrique : cancer => 95% Cag+ gastrite non-atrophique => 40 % Cag+ - Contient 22 gènes requis pour la synthèse d'un système de sécrétion de type IV (SST4) Cellule épithéliale H. pylori Membrane interne Membrane externe

une molécule pro-oncogène CagA, une molécule pro-oncogène injectée par le SST4 Cag H. pylori récepteur intégrines 5 ß1 SST4 Cellule épithéliale fragments de PG Viala et al. Nature Immunol. 2004 Activation de NF-kB => Stimulation de la transcription de la cytokine pro-inflammatoire IL-8 Nod1 CagA - Remaniement du cytosquelette (augmentation de la mobilité et élongation cellulaire) - Prolifération cellulaire CagA P SHP2 SRC ABL CagA P CSK Perturbation - des jonctions serrées et adhérentes - de la polarité cellulaire CagA JAM ZO-1 ß-catenin Activation anormale Hyperprolifération et différentiation aberrante The first effector discovered is the protein cagA. After the delivery of cagA into the eukaryotic cell, the protein is phosphorylated at one or more phosphorylation motifs by scr kynase. This interferre with actin polymerisation and lead to cytoskeletal rearrangements. Rôle du SST4 Cag dans la transformation des cellules épithéliales gastriques (D'après Polk and Peek, Nature Reviews Cancer, 2010)

Métaplasie intestinale Effet de l’éradication de H. pylori sur le développement du cancer gastrique Traitement du MALT: 80 % de régression après éradication de H. pylori Effet bénéfique de l'éradication de H. pylori sur l'évolution des lésions pré-néoplasiques (Méta-analyse par Rokkas et al. Helicobacter 2007) Gastrite chronique Atrophie gastrique Métaplasie intestinale Dysplasie Adénocarcinome Atrophie gastrique Amélioration dans l'antre et le corps Métaplasie intestinale Aucune amélioration Point de “non-retour” ?

Conclusions Helicobacter pylori : une bactérie de découverte récente responsable de diverses pathologies de l'estomac chez l'homme. H. pylori colonise de manière persistante la moitié de la population humaine mondiale (800 000 morts/an). H. pylori = la seule bactérie reconnue comme oncogène de classe 1 (MALT et adénocarcinome). Adénocarcinome apparaît après des décades d'infection par H. pylori mutagenèse de l'ADN des cellules hôtes (inflammation, AID). diminution de l'expression de facteurs de réparation de l'ADN. expression de facteurs de virulence (VacA et Cag) qui augmentent le risque d'oncogenèse. L'éradication de H. pylori fait régresser le MALT et elle est bénéfique pour l'évolution des lésions pré-oncogènes.

H. pylori possède des propriétés uniques qui lui permettrent de survivre et de se multiplier à long terme dans l’estomac, un organe pourtant hostile...

Barrière chimique : acidité cellules épithéliales pH médian : 2 pH 4.5-6 Barrière physique : mucus très épais pH neutre cellules épithéliales Barrière biologique : réponse immunitaire Adapté de Tortora, Funke and Case "Microbiology, an introduction" editeur Pearson

Barrière immunologique Motifs Lewis : mimétisme moléculaire Immuno-suppression

Barrière physique : mucus très épais Forme spiralée pour pénétrer dans le mucus Flagelles pour se déplacer dans le mucus

Barrière chimique : pH très acide NH4+ H+ H+ H+ Uréase 2 NH3 + CO2 H+ H+ = O NH2-C-NH2 + H2O

Urease : un facteur de virulence majeur de H. pylori Enzyme essentielle pour la résistance à l'acidité, indispensable à la colonisation de modèles animaux Urease : 10% protéines totales de H. pylori Uréase de H. pylori, la plus active de toutes les uréases décrites (Km=0,2-0,5 mM) Au niveau des cellules épithéliales gastriques de l'hôte l'ammoniac produit par H. pylori est cytotoxique la présence d'ammoniac accélère l'induction de l'apoptose induite par la cytokine TNF

Urease : une métalloenzyme à nickel 24 nickel ions par complexe actif d'uréase [(UreA-UreB)3]4

Uréase : une arme à double tranchant à pH acide : activité indispensable à la survie de H. pylori à pH neutre : production d'ammoniac délétère car conduit à un pH alcalin toxique pour H. pylori Ni2+

Tests de la réponse de H. pylori à l'acidité in vitro 2x108 bact./ml PBS pH 7.0 H. pylori PBS pH 2 + 10mM urée PBS pH 7.0 + 10mM urée 37°C - 1 H pH Compte-viable des bactéries

Nécessité pour la bactérie de contrôler son activité uréase Incubation sans urée pH = 6.5 pH = 7 pH = 9 1 H 108 CFU/ml pH = 2 pH initial pH final Incubation avec urée Toxique pH initial pH final pH = 7 pH = 7 108 CFU/ml pH = 2 pH = 2 1 H Nécessité pour la bactérie de contrôler son activité uréase

Plusieurs niveaux de contrôle de l'activité uréase chez H. pylori Identification de mécanismes originaux Accessibilité de son substrat, l'urée Transport de son co-facteur, le nickel Incorporation du nickel dans son site actif - Stockage du nickel

P H+ UreHEFG (UreA-UreB)6 Construction d'un mutant de H. pylori DureI Canal à urée UreI H+ Urée P ureA ureB ureI ureE ureF ureG ureH Sous-unités catalytiques Protéines accessoires UreHEFG Ni2+ (UreA-UreB)6 Construction d'un mutant de H. pylori DureI -> activité uréase identique à celle de la souche sauvage (sur des lysats) Skouloubris et al. Infect & Immun 1998 Bury-Moné et al. Mol Microbiol 2001 et 2004

Mutant de H. pylori DureI Incubation avec urée pH initial pH final pH initial pH final pH = 9 9 pH = 9 8 pH = 7 pH = 7 pH = 6.5 7 6 108 CFU/ml 5 4 3 pH = 2.5 pH = 2 pH = 2 2 105 CFU/ml 1 1 H 1 H 1 Souche de H. pylori sauvage Mutant de H. pylori DureI UreI est nécessaire pour la survie de H. pylori à pH acide en présence d'urée Démonstration du transport de l'urée à pH acide par UreI dans un système hétérologue (oocytes de Xénopes) Weeks et al. 2001

Inoculation par voie orogastrique de 109 bactéries (souche SS1) H. pylori sauvage 109 10 20 2 7 14 28 Charge bactérienne (CFU/g estomac) 101 102 103 104 105 106 107 108 H. pylori ureI (Skouloubris et al. I&I 1998) jours Contrôle négatif Sacrifice 1 2 3 4 semaines Compte-viable La protéine UreI est essentielle pour la colonisation d'un modèle animal par H. pylori

Uréase UreI = canal à urée dans la membrane interne H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ NH4+ Urée NH3 + CO2 H+ UreI Uréase these are the two steps that I will be talking about H+ Urée UreI = canal à urée dans la membrane interne de la bactérie ouvert uniquement à pH acide (cible thérapeutique - brevet)

Plusieurs niveaux de contrôle de l'activité uréase chez H. pylori Identification de mécanismes originaux Accessibilité de son substrat, l'urée Transport de son co-facteur, le nickel Incorporation du nickel dans son site actif

est un élément de virulence L'acquisition des métaux par les bactéries pathogènes au sein de leur hôte est un élément de virulence Il est essentiel pour Helicobacter pylori de se procurer du nickel dans l’estomac de son hôte Nickel

Concentration du nickel dans le corps humain est très faible : 2-11 nM Acquisition du nickel par H. pylori Environnement gastrique : complexe et varié biodisponibilité des ions métalliques ? Concentration du nickel dans le corps humain est très faible : 2-11 nM Comment le nickel est-il transporté à travers la membrane externe (ME) ? Aucune source d'énergie disponible au niveau de la ME Ni2+ NixA ? MI ME

Transporteur dépendant de TonB = TBDT Le complexe TonB/ExbB/ExbD fournit de l'énergie pour le transport à travers la membrane externe (ME) en utilisant la force proto-motrice de la membrane interne (MI) Modified from Braun & Braun Substrate-binding site Transporteur dépendant de TonB = TBDT Substrats du système TonB : Fer chélaté (sidérophores) Cobalamin, vitamine B12 (cofacteur cobalt) ME MI

La machinerie ExbB/ExbD/TonB est impliquée dans le transport du fer chez H. pylori Question: est-ce que TonB est requis pour le transport énergisé du nickel ? Kristine SCHAUER

Mesures du contenu intracellulaire en nickel par la technique de "Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry" (ICP-MS) pH 7 A pH 7, peu de nickel accumulé indépendamment de TonB µmol Ni2+ /g prot pH 5 Ni2+ mutant ∆exbB-exbD-tonB + mutant complémenté A pH 5, augmentation de l'accumulation du nickel, dépend de TonB

Identification du transporteur TonB-dépendant FrpB4 présente les caractéristiques d'un TBDT localisée dans la membrane externe (Ernst et al. 2006 J. Bact) régulée par NikR en réponse au nickel (Muller et al. 2011 NAR) Mutant ∆frpB4, même phénotype que le mutant ∆exbB-D-tonB Modified from Braun & Braun

Conséquences du transport du nickel TonB-dépendant sur l'activité uréase pH 7 pH 5 A pH 7, accumulation du nickel TonB-indépendante => activation de l'uréase A pH 5, à des faibles doses de nickel => Machinerie ExbB/ExbD/TonB + FrpB4 nécessaires à l'activité uréase

Première démonstration d'un transport du nickel à travers la ME par un mécanisme dépendant de la machinerie TonB Nickel H+ FrpB4 = Transporteur de nickel dépendant de TonB Transport de nickel est activé à pH acide Activation de l'uréase à pH acide par l'apport de nickel ME FrpB4 H+ TonB ExbD NixA MI ExbB PMF Schauer et al. Molec Microbiol (2007) Uréase Schauer, Rodionov et al. TIBS (2008)

Plusieurs niveaux de contrôle de l'activité uréase chez H. pylori Identification de mécanismes originaux Accessibilité de son substrat, l'urée Transport de son co-facteur, le nickel Incorporation du nickel dans son site actif

Incorporation du nickel dans l'uréase par des complexes protéiques Carte génomique d'interaction protéiques par paires (Y2H) Nature (2001), Mol Microbiol (2001), NAR (2003) Purification de complexes multi-protéiques à partir de l'organisme d'origine => Meilleure spécificité des complexes (moins de faux positifs) Purification de complexes protéiques par la technique TAP, Tandem Affinity Purification (Kerstin STINGL)

Recherche de complexes protéiques associés à l'uréase chez H. pylori par TAP

Identification de deux populations de complexes un complexe enzymatique actif associé à des enzymes du métabolisme de NH3 un complexe d'incorporation du nickel partagé avec celui de l'hydrogénase (distribution du nickel) Urease Ni2+ Hydrogenase Complexes protéiques pour l'incorporation du nickel

Nouveaux mécanismes pour l'acquisition du nickel, activés à bas pH NixA Nouveaux mécanismes pour l'acquisition du nickel, activés à bas pH FrpB4 TonB-ExBD Ni2+ Complexes protéiques pour l'incorporation du nickel Urée H+ UreI Canal à urée activé à pH acide Urease Hydrogenase

est une bactérie fascinante ! Helicobacter pylori est une bactérie fascinante ! - il reste beaucoup d’aspects de sa virulence à comprendre - elle constitue un bon système d’étude * pour comprendre les processus qui conduisent au cancer * pour identifier de nouveaux mécanismes ou de nouvelles fonctions dont certains peuvent être communs à d’autres bactéries pathogènes

Pour en savoir plus sur H. pylori http://www.helicobacter.fr./

Unité Pathogenèse de Helicobacter Sylvie AUBERT ERL3526 Julien GALLAUD Daniel VINELLA Yulia REDKO Karine ANGER Mécénat Valérie MICHEL Janssen ODYSSEY-Re Eliette TOUATI Julien FERNANDES Hilde DE REUSE Unité Pathogenèse de Helicobacter Mireille FERRAND

Laboratoire de Chimie et Biologie des Métaux (CEA/CNRS Grenoble) Christelle BALHAWANE Isabelle MICHAUD-SORET Laboratoire de Cristallographie et Cristallogenèse des Protéines (CEA/CNRS Grenoble) Christine CAVAZZA Laboratoire CEA de Cadarache DSV/IBEB/SBVME/LB3M Pierre RICHAUD Groupe de Cristallographie Macromoléculaire (ESRF Grenoble), now at IBCP Lyon Cyril DIAN Laurent TERRADOT Génopole IP (Proteopole) Pascal LENORMAND Jean-Claude ROUSSELLE Abdelkader NAMANE Burnham Institute, La Jolla USA Dmitry RODIONOV

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