Identification de facteurs impliqués dans la Mécanosensibilité colique. Alison Accarie / 1er année de thèse Directeur de thèse : Pr. Michel Dapoigny Directeurs du laboratoire : Pr. Alain Eschalier et Pr. Denis Ardid UMR/INSERM 1107 Neuro Dol, Pharmacologie Fondamentale et Clinique de la douleur

Introduction U1107 / Pharmacologie fondamentale et clinique de la douleur  prise en charge insuffisante des douleurs chroniques Axe : Douleur viscérale Douleurs abdominales Douleurs coliques Première cause de consultation en gastroentérologie Symptôme commun au SII et MICI en période de rémission SII : syndrome intestin irritable MICI : maladie inflammatoire chroniques de l’intestin

hypersensibilité colique Introduction Douleurs coliques 2/3 des cas hypersensibilité colique réponse exacerbée à un stimulus douloureux ou non sensibilisation au niveau périphérique (organe cible) Probablement d’origine mécanique Compression d’organes (cancer) Distension (ballonnements)

Introduction mécanosensation colique : différents senseurs périphériques Intégration centrale

Senseurs périphériques? Pas de rôle clair. Introduction Mécanosensibilité colique : implication de canaux ioniques Stuart M. Brierley Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical 2010 ASIC (Acid sensing ion channels): sensible au pH TRPV (Transient Receptor Potential Vanilloid) : sensible au chaud TRPA (Transient Receptor Potential family A): sensible au stretch, température et irritants Senseurs périphériques? Pas de rôle clair.

Introduction Identification d’un nouveau Facteur de Transcription dans cas de stimulation mécanique des tiges chez Arabidopsis & Popular sp. (Equipe MECA, UMR PIAF) PtaZFP2 Expression précoce Motif doigt de zinc Mécanosenseurs présents aussi chez les plantes, avec équivalent génique chez l’animal

Introduction Cinétique d’expression courte Induit pour une stimulation Phénomène de sensibilisation Martin, 2009 NGF1-C/egr-4 équivalent génique de PtaZFP2 chez la souris

Introduction Famille Egr : 4 sous types Facteur de transcription / Gène de réponse précoce Structure à doigt de zinc liaison à l’ADN Cys2-His2 Modulation d’expression de gènes lors de la transmission nerveuses Même séquence de reconnaissance de l’ADN : GCC G/TGG GCG Induction par NGF (culture cellulaire ) Impliqué dans stimuli douloureux Zhican Qu 1998

Introduction Egr-4 : Deux principales études Impliqué dans mecanosensation (vibris et cortex somata-sensoriel) suite à un stimulus mécanique physiologique PCR ARNm egr-4 (Mack et al., 1995).

Objectif de la thèse Implications et rôles du facteur de transcription EGR-4 en tant mécano senseur

Objectifs Implications et rôles du facteur de transcription EGR-4 en tant que mécanosenseurs Egr-4 impliqué dans Hypersensibilité colique chez l’animal? Quels sont ces partenaires? Par quels mécanismes cela passe-t-il?

Plan de travail Rôle dans Mécanosensibilité viscérale? Dans quels tissus et à quel moment est-il le plus présent? Souris saines Caractérisation de la cible Quels sont les partenaires?

Plan de travail Rôle dans Mécanosensibilité viscérale? Dans quels tissus et à quel moment est-il le plus présent? Souris saines Caractérisation de la cible Quels sont les partenaires? Modification d’expression? Modèle post-infectieux Cinétique différente? Implication dans hypersensibilité colique? Modèle stress Changement de partenaires?

seringue + sonde rectale Protocole Souris wt sans traitement. Distension à 100 µL pendant 10 s. Prélèvement 30 min, 1h30 et 3h30 après distension. Colon Partie distendue Moelle DRG viscéraux L6 et S1 seringue + sonde rectale

Premiers résultats IHC Anticorps au point pour les trois structure Colocalisation avec des fibres nerveuses plus précisement sensitives Egr-4 nucléaire et/ou cytoplasmique Paraffine Anti-NGFI-C 1:500 Anti-goat (secondaire) 1:1000

Premiers résultats IHC seringue + sonde rectale Colon

Premiers résultats IHC Colon DRG cytoplasme DRG noyau

Premiers résultats IHC Colon DRG cytoplasme DRG noyau Corne dorsale de la moelle épinière

Egr-4 colon souris distendus vs non distendus protéine ARNm C 30 1h30  baisse d’expression de egr 4 au niveau colique

Egr-4 DRG souris distendus vs non distendus ARNm protéine C 30 1h30  baisse d’expression de egr 4 dans les DRG

Egr-4 moelle souris distendus vs non distendus ARNm protéine C 30 1h30  augmentation de EGR4 dans la moelle.

Conclusion Outils d’études (PCR, WB, IHC) disponibles et mis au point Résultats avec des tendances différentes de ceux obtenus chez la plante et au niveau cérébral chez la souris (confirmation en cours). Confirmation de l’intérêt de l’étude de cette cible dans la mécanosensibilité

Suite du travail Cinétique d’expression du facteur. ARNm DCR 30 (45) 1h (1h15) 1h30 Proteine DCR (1h) 1h30 (2h) 2h30 (3h) 3h30

Suite du travail Cinétique d’expression du facteur. Localisation plus fine en immunohistologie (whole mount).

Suite du travail Cinétique d’expression du facteur. Localisation plus fine en immunohistologie (whole mount). Identification des cibles et partenaires. choc osmotique qPCR Culture cellulaire MODE-K WB microarray

Merci de votre attention

Corrélation volume de distension-expression egr-4 ARN m et protéine Distension des animaux avec différents volumes : 20 µl 40 µl 60 µl 80 µl 100 µl 120 µl qPCR Prélèvements au temps choisis Western Blot

Modèle post-infectieux Souris KI pour le gène humain ceacam6 : site de liaison LF82  meilleure implantation des bactéries J-3 J-2 J0 J1 J2 J3 J9 Gavage PBS ou 109 CFU/souris (AIEC LF82 ouMG1655) Implantation électrodes Distension colorectale Administration néomycine (2 g/mL) dans eau de boisson

Résultats modèle post-infectieux DCR J9

Résultats modèle stress Réponse moyenne de sensibilité colique DCR réalisée à l’age adulte