INFECTION ET MUCOVISCIDOSE JOURNEES SCIENTIFIQUES DE LA FEDERATION DES CRCM 3 et 4 décembre 2009, Paris JS Fed Fr CRCM 3-4/12/2009 Paris

EVOLUTION DES TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC ET DES CONCEPTS EN BACTERIOLOGIE Gérard CHABANON, Christine SEGONDS Observatoire B. cepacia Laboratoire Bactériologie-Hygiène IFB – Hôpital Purpan Faculté de Médecine Rangueil Toulouse JS Fed Fr CRCM 3-4/12/2009 Paris

II – FACTEURS D’EVOLUTION III – EMERGENCE NOUVEAUX OUTILS I – ETAT DES LIEUX II – FACTEURS D’EVOLUTION III – EMERGENCE NOUVEAUX OUTILS NOUVEAUX CONCEPTS JS Fed Fr CRCM 3-4/12/2009 Paris

I - ETAT DES LIEUX (l) MODES OPERATOIRES ET TECHNIQUES BACTERIOLOGIQUES (Rémic : référentiel en bactériologie médicale, 2007) 1/ RECUEIL DES PRELEVEMENTS LBA : pvt de référence mais invasif Oropharyngé (écouvillon) : - non validé ; limité aux jeunes enfants si recueil expectoration irréalisable - comparaison écouvillon vs LBA : P. aeruginosa VP +ve 57-83% S. aureus VP +ve 27-91% (variation liée à la densité bactérienne dans pvt et âge du patient <18 mois) ECBC : le plus utilisé - kinésithérapie ; sérum hypertonique - examen direct bien souvent peu informatif JS Fed Fr CRCM 3-4/12/2009 Paris

ETAT DES LIEUX (2) MODES OPERATOIRES ET TECHNIQUES BACTERIOLOGIQUES (Rémic : référentiel en bactériologie médicale, 2007) 2/ EXAMEN BACTERIOLOGIQUE 2.1. Préparation et ensemencement du prélèvement - homogéinisation/fluidification - dilutions utiles : 10-2 et 10-5 (seuil de détection 102 UFC/ml +++) - milieux de culture inoculés : standard non sélectifs et sélectifs (S.aureus, P.aeruginosa, S. maltophilia, spéciaux (Burkholderia) ; mycologie - surveillance des milieux jusqu’à une semaine (Burkholderia) Rappel : recherche mycobactéries : demande spéciale JS Fed Fr CRCM 3-4/12/2009 Paris

ETAT DES LIEUX (3) MODES OPERATOIRES ET TECHNIQUES BACTERIOLOGIQUES (Rémic : référentiel en bactériologie médicale, 2007) 2.2. Identification : deux situations selon espèces bactériennes considérées - phénotypique (galerie biochimique d’identification) S.aureus, P. aeruginosa… S. maltophilia, A.xylosoxidans…. - génomique (bio.mol.) ex : Bcc et espèces apparentées * méthodes universelles : ADNr 16S . ARDRA : polymorphisme . séquençage; plus exhaustif * gène précis, d’intérêt . rec A (Bcc) . gyr B (Pandoraea) JS Fed Fr CRCM 3-4/12/2009 Paris

(Document : Observatoire B.cepacia, CHU Toulouse) B. gladioli B. cepacia complex pathovar gladioli CFBP 2427T pathovar alliicola CFBP 2422T B. cenocepacia J2315T B. multivorans LMG13010T MW 1 2 3 4 5 MW 1 2 3 4 5 MW MW 1 2 3 4 5 MW 1 2 3 4 5 MW Bp - 900 - - 501 - - 320 - - 190 - Profile B B B B A B B F B A A A A A A A A I A B MW : molecular weight marker VIII. 1, AluI; 2, CfoI; 3, DdeI; 4, MspI; 5, XmnI (Document : Observatoire B.cepacia, CHU Toulouse) JS Fed Fr CRCM 3-4/12/2009 Paris

Bactéries cliniquement importantes en % selon l’âge-- Registre Muco 2006 - JS Fed Fr CRCM 3-4/12/2009 Paris

ETAT DES LIEUX (4) MODES OPERATOIRES ET TECHNIQUES BACTERIOLOGIQUES (Rémic : référentiel en bactériologie médicale, 2007) 2.3. Antibiogramme - la doctrine : 1 souche 1 antibiogramme mais difficultés de réalisation  Propositions : antibiogramme « global » . disques et par diffusion . E. test et par diffusion - en pratique . antibiogramme automatique en milieu liquide présente des limites : métaboliques ; mucoïdes, variants à petites colonies … diffusion . modification des règles de lecture du CA – SFM – pour certaines molécules : S I ; I  R  - E test recommandé (P.aeruginosa) . colimycine : contrôle souches « R » . tobramycine : surveillance CMI lors de TOBI* JS Fed Fr CRCM 3-4/12/2009 Paris

Colonisation chronique Infection broncho-pulmonaire ELEMENTS DE DEFINITION ETATS COLONISATION/INFECTION DE P.AERUGINOSA (Conférence de consensus, 2002) Primo colonisation Colonisation chronique Infection broncho-pulmonaire Infection broncho-pulmonaire chronique Rappel : recommandations : qualité des prélèvements seuil de dénombrement des différentes espèces ; milieux de culture utilisés ; identification ou non des bactéries isolées ; réalisation éventuelle d’un antibiogramme. JS Fed Fr CRCM 3-4/12/2009 Paris

ETAT DES LIEUX (5) MODES OPERATOIRES ET TECHNIQUES BACTERIOLOGIQUES (Rémic : référentiel en bactériologie médicale, 2007) Espèces Antibiogramme si Commentaires S. aureus ≥ 102 UFC/ml Signaler les variants à petites colonies P.aeruginosa Signaler les souches mucoïdes Inquilinus limosus, Pandoraea spp. S. maltophilia, A. Xylosoxidans, Ralstonia spp. ≥ 105 UFC/ml Entérobactéries H. influenzae Moraxella spp S. pneumoniae Rappel : rechercher des AC spécifiques vis-à-vis de P.aeruginosa

II - FACTEURS D’EVOLUTION 2002 mise en place en France du dépistage néonatal systématique de la MV ; double impact :  évolution de la prise en charge des patients (recommandations ANAES/HAS, 2002)  modification de la réalité des données colligées et exploitées (Registres ; mesures correctives) Symptômes respiratoires constituent toujours le signe d’appel le plus fréquent du diagnostic de MV (ensemble population) (données 2006 Registre français mucoviscidose) Apport du laboratoire de bactériologie n’est plus limité aux seules données utiles à la conduite de l’antibiothérapie JS Fed Fr CRCM 3-4/12/2009 Paris

III - EMERGENCE NOUVEAUX OUTILS NOUVEAUX CONCEPTS JS Fed Fr CRCM 3-4/12/2009 Paris

EMERGENCE (l) Emergence ou émergent, terme retrouvé dans de très nombreux domaines du savoir : physique, biologie, socio-économique, linguistique…. politique Emergence est un phénomène marqué par l’apparition de nouvelles caractéristiques dotées, bien souvent, d’un certain degré de complexité Maladie émergente ; bactérie émergente JS Fed Fr CRCM 3-4/12/2009 Paris

EMERGENCE (2) Deux exemples : émergence et MV Burkholderia cepacia Streptococcus du groupe milleri (SMG) (S. anginosus, S. constellatus, S. intermedius) Commentaires * Mode « déclaratif » différent : oui B. cenoceopacia – clone ET12 épidémique - hautement transmissible : patient/patient centre de soins/centre de soins ; plusieurs pays concernés - cas d’évolution rapidement fatale : « syndrome cepacia » SMG - cas sporadiques ; non clonal - traduction clinique « classique », bactérie pyogene - impact respiratoire - signalement des cas : semble en augmentation JS Fed Fr CRCM 3-4/12/2009 Paris

* Bactéries « nouvelles » : non B. cenocepacia : présente dans environnement naturel ; phytopathogène ; infections nosocomiales SMG : composante flore oropharyngée ; groupe bactérien hétérogène ; pathologies « invasives » suppurées (abcès cérébral, hépatique, empyème…) mais précautions particulières d’isolement contexte MV car toutes deux fréquemment associées à P. aeruginosa. *Bactéries naturellement plus résistantes aux antibiotiques ? B. cenocepacia : oui SMG : non (rôle de pression de sélection des antibiothérapies ?) JS Fed Fr CRCM 3-4/12/2009 Paris

NOUVEAUX CONCEPTS ; NOUVEAUX OUTILS (l) Introduction Progrès technologiques  meilleure connaissance des génomes Meilleure connaissance des génomes possibilités nouvelles offertes au diagnostic bacteriologique Champs d’application Détection Identification Caractérisation « fine » : TYPAGE JS Fed Fr CRCM 3-4/12/2009 Paris

NOUVEAUX CONCEPTS ; NOUVEAUX OUTILS (2) Détection directe d’une espèce(s) bactérienne(s) d’intérêt Deux exemples : - P. aeruginosa ; détection précoce dans le sputum Détection of Low Pseudomonas aeruginosa (PA) Colonization by real time polymerase chain reaction. T. Billard, S. Herwegh, N. Wizla, D. Turck, MO Husson – S156, 31 St ECFC, Prague 2008) Résultats préliminaires : permettent de penser que cette méthode d’amplification génique (Orpl), rapide dans sa réalisation, pourrait être plus sensible que les méthodes traditionnelles pour la détection des états de colonisation précoce par PA JS Fed Fr CRCM 3-4/12/2009 Paris

- Programme de soutien aux techniques inovantes coûteuses ; recensement des propositions ; préparation de l’appel à projet national DHOS, 2010 Réponse : « étude de la détection par PCR en temps réel, « multiplex » de divers agents bactériens : mycoplasmes, chlamydia… ; virus ; champignons ? dans les sécrétions trachéo-bronchiques lors d’infections respiratoires chez l’enfant ; étude multicentrique » (coordinateur du projet : Pr. B. Pozzeto, CHU Saint-Etienne) JS Fed Fr CRCM 3-4/12/2009 Paris

NOUVEAUX CONCEPTS ; NOUVEAUX OUTILS (3) Identification : Genre et espèce sur colonie : spectrométrie de masse (MALDI-TOF-MS) Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization – Time of Flight Mass Spectrometry for Identification of Non fermenting Gram-Negative Bacilli Isolated from Cystic Fibrosis Patients. N. Degand et al., JCM, 2008 - Analyse des protéines ribosomales de la bactérie ; expression constante et conservées. - Méthode rapide, tout à fait performante d’identification des BGN NF ; nécessité en raison de quelques erreurs pour certaines espèces d’augmenter la collection des souches cliniques (base de données). - Méthode d’avenir inconstestable ; routine In situ : exemple : étude des anaérobies dans les sécrétions trachéo-bronchiques des patients MV JS Fed Fr CRCM 3-4/12/2009 Paris

1 - Jewes LA, et al. The incidence of anaerobes in the sputum of patients with cystic fibrosis. J Med Microbiol 1990 ; 31 : 271-274 2 - Rogers GB, et al. Characterization of bacterial community diversity in cystic fibrosis lung infections by use of 16s ribosomal DNA terminal restriction fragment length polymorphism profiling. J Clin Microbiol 2004 ; 42 : 5176-5183 3 - Bittar F, et al. Molecular detection of multiple emerging pathogens in sputa from cystic fibrosis patients, S161, 31ST ECFC, Prague, 2008 4 - Tunney MM, et al. Detectionof anaerobic bacteria in high numbers in sputum patients with cystic fibrosis. Am J Respir Crit Care Med 2008 ; 177 : 995-1001 5 - Worlitzsch D, et al. Antibiotic-resistant obligate anaerobes during exacerbations of cystic fibrosis patients. Clin Microbiol Infect 2009; 15 : 454-460 JS Fed Fr CRCM 3-4/12/2009 Paris

COMMENTAIRES (l) - bactéries anaérobies sont présentes dans les prélèvements respiratoires (sputum ; LBA) de patients MV genres bactériens concernés : Prevotella, Veillonella, Propionibacterium (Actinomyces ≠Atopobium) taille globale de la population anaérobie peut atteindre des valeurs « significatives » 104 – 108 (problème qualité du pvt) témoin : absence d’anaérobies ou si présents n’appartiennent pas aux Genres « majoritaires » Veillonella et Propionibacterium (Actinomyces, Prevotella) ; taille population moins importante fréquentes co-cultures anaérobies/P.aeruginosa ; la présence de P. aeruginosa ne semble pas globalement modifier la taille de la population anaérobie (controverse) JS Fed Fr CRCM 3-4/12/2009 Paris

COMMENTAIRES (2) Ce type d’étude associant techniques classiques et techniques par biologie moléculaire : . montre qu’au-delà du nombre modeste de bactéries pathogènes reconnues, il existe une population pluri microbienne , « microbiote » . permet de s’interroger : ./ sur le rôle pathogène d’autres espèces microbiennes (connues ou inconnues jusque là) ./ sur le rôle de la plasticité/« profiling » de ce microbiote dans la détérioration de la fonction respiratoire   primocolonisation – infection – exacerbation - rémission JS Fed Fr CRCM 3-4/12/2009 Paris

Deux études A polymicrobial perspective of pulmonary infections exposes an enigmatic pathogen in cystic fibrosis patients. Sibley, DC, et al., PNAS, 105 : 15070-15075, 2008 outil : T-RFLP : Terminal Restriction Fragment Length Polymorphisme (16SrDNA) RISA-HPLC analysis of lung bacterial colonizers of cystic fibrosis children. Nazaret, S. et al, J Microbiol Methods, 46 : 58-69, 2009 outil : RISA : Ribosomic Intergenic Spacer Analysis couplée HPLC JS Fed Fr CRCM 3-4/12/2009 Paris

T-RFLP analysis of the microbial communities in sputum samples collected at admission to hospital for the first exacerbation and during the following year (days 1 to 368) and 5 retrospective samples (days −1784 to −121) T-RFLP analysis of the microbial communities in sputum samples collected at admission to hospital for the first exacerbation and during the following year (days 1 to 368) and 5 retrospective samples (days −1784 to −121). The retrospective samples are shown left of the dashed line. The size in base pairs of each of the T-RFs detected during the 6-year period is shown on the left. * indicates T-RFs whereby bacterial species can be assigned by using in silico analysis. The abundance of each T-RF is plotted by using the legend. The names of the bacterial species cultivated from sputum are shown beside the T-RF for which they correspond. Green and red are the P. aeruginosa and S. constellatus T-RFs, respectively. Sibley C D et al. PNAS 2008;105:15070-15075 JS Fed Fr CRCM 3-4/12/2009 Paris

Typage : aujourd’hui son « périmètre « de définition doit être élargi classiquement : typage phénotypique : - biotype, sérotype, bactériocinotype, lysotype…, marques d’une certaine diversité de souches au sein d’une même espèce - des marqueurs phénotypiques utilisés pour typage épidémiologique : ex : suivi diffusion d’un sérotype donné ; JS Fed Fr CRCM 3-4/12/2009 Paris

typage moléculaire : « méthodes anonymes » - essor avec la gestion des infections nosocomiales à caractère épidémique (médico-légal) ou spécifiques : toxi infections, (conséquences santé publique ou/et économique….) - analyse comparative des souches sur la base des produit issus amplification PCR de gènes ou d’espace intergénique : ERIC PCR, ribotypage, PCR ribotypage… macrorestriction de l’ADN total : EPCP - méthodes dites « anonymes » bien adaptées à l’étude des cas groupés (temps et espace) mais insuffisantes : diffusion de souches étalée dans le temps (infections chroniques) ; comparaison des souches à grande échelle : nationale, internationale JS Fed Fr CRCM 3-4/12/2009 Paris

(doc M. Thouverez, CHU Besancon) % Similarity 100 80 60 40 20 Isolate Origin PFGE pattern 5 CF patient, Lyon A 16 Non CF patient, Nantes A 14 CF patient, Saint-Pierre Réunion B 4 CF patient, Lyon C1 6 CF patient, Paris C2 12 CF patient, Saint-Pierre réunion D 9 CF patient, Pontoise E 11 CF patient, Saint-Denis Réunion E 1 CF patient, Dax F 17 Non CF patient, Toulouse G 8 CF patient, Paris H 13 CF patient, Saint-Pierre Réunion I 3 CF patient, Lyon J 10 CF patient, Saint-Denis Réunion K 15 Non CF patient, Cahors L 18 Non CF patient, Toulouse M 2 CF patient, Dijon N 7 CF patient, Paris O PFGE dendrogram constructed using the UPGMA algorithm of the 18 clinical isolates of B.gladioli (doc M. Thouverez, CHU Besancon) JS Fed Fr CRCM 3-4/12/2009 Paris

Typage moléculaire : « méthodes d’épidémiologie globales » MLST Multi Locus Sequence Typing (Baldwin) – 2005 . 7 gènes domestiques : atpD, gltB, gyrB, recA, lepA, phaC, typB . amplification suivie séquençage ; base de données +++ . mal adapté pour un suivi en continu des isolats cliniques, réservé aux études de biodiversité +++ JS Fed Fr CRCM 3-4/12/2009 Paris

MLVA : Multi Locus VNTR Analysis (VNTR : Variable Number of Tandem Repeats) . gènes régulièrement présents dans les génomes bactériens, en nombre variable, de séquence nucléotidique de faible taille et variable (micro/mini satellites) . comparaison basée sur des variations : ./ nombre de séquences présentes ./ et leur polymorphisme . base de données +++ JS Fed Fr CRCM 3-4/12/2009 Paris

Domaine d’application de MLVA : - M. tuberculosis ; B. anthracis, L. pneumophila, B. pseudomallei et mallei - MV : P. aeruginosa ; S. aureus, résultats intéressants Burkholderia en développement (OBC) Intérêt technique MLVA versus MLST - mise en oeuvre plus aisée, moins onéreuse ; souplesse d’utilisation, répond mieux au suivi des isolats cliniques JS Fed Fr CRCM 3-4/12/2009 Paris

MLST seul et surtout associé à d’autres techniques (micro arrays); tests de pathogénicité in vivo) … offre l’information la plus poussée disponible sur le support génétique impliqué : écologie, biologie et évolution d’une population bactérienne donnée, en un site donné translocation – environnement naturel  hôte Burkholderia ; P. aeruginosa expression de la pathogenicité JS Fed Fr CRCM 3-4/12/2009 Paris

Population structure of Pseudomonas aeruginosa Wiehlmann,L. et al. , PNAS, 2007, 104 : 8101-8106 Genetic diversity and Multihost Pathogenicity of Clinical and Environnmental Strains of Burkholderia cenocepacia Springman, AC et al., Appl. Environ. Microbiol., 2009, 5250-5260 Objectif commun : meilleure connaissance du positionnement des souches bactériennes (Burkholderia, P. aeruginosa) isolées chez l’homme au cours et en dehors de la MV ; comparaison avec celles présentes dans l’environnement naturel JS Fed Fr CRCM 3-4/12/2009 Paris

Widespread geographic distribution of major P. aeruginosa clones Widespread geographic distribution of major P. aeruginosa clones. Clones are depicted by uppercase letters and are arranged by decreasing frequency in alphabetical order. Source and origin of strains are listed in SI Table 3. The most abundant clone, A, is represented by the sequenced strain PA14 (27). Wiehlmann L et al. PNAS 2007;104:8101-8106 JS Fed Fr CRCM 3-4/12/2009 Paris ©2007 by National Academy of Sciences

Wiehlmann L et al. PNAS 2007;104:8101-8106 JS Fed Fr CRCM 3-4/12/2009 Paris

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Remerciements Michèle THOUVEREZ, CHU Besancon François BREMONT, Marlène MURRIS, CRCM adulte et enfants, CHU Toulouse Marie-louise ABALAIN, CHU Brest Christine POURCIEL, Paris-Orsay CNRS Benoît COURNOYER, UL1/CNRS Ecologie Microbienne Equipe Observatoire B. cepacia, CHU Toulouse/Faculté de Médecine Toulouse-Rangueil JS Fed Fr CRCM 3-4/12/2009 Paris