Mise en évidence de l'activation du lymphocyte
Activation du LT4 à l’aide des anticorps Anticorps anti-TCR LT4 TCR Anticorps anti-CD4 Protéine CD4 du LT4
Protéines phosphorylées Dans le contrôle positif on a mis des protéines phosphorylées pour être sûr que le test fonctionne. Dans le contrôle négatif on a mis des LT4 non activés. LT4 non activés Protéines phosphorylées Contrôle positif Contrôle négatif
Protéine phosphorylée Cytoplasme du LT4 ATP=ADP+Pi P noyau Protéine phosphorylée Activation du LT4
Lyse totale (membrane plasmique+membrane nucléaire) de la cellule avec le tampon de lyse. ADN Tube
Migration des protéines dans le gel d’acrylamide En chargeant négativement toutes les protéines grâce au SDS, l’électrophorèse va permettre de faire migrer les protéines uniquement en fonction de leur masse. Marqueur de masse moléculaire - CD4 + Gel stacking TCR Gel running
Tampon de transfert (nitrocellulose) Transfert du gel sur nitrocellulose Protéines Tampon de transfert (nitrocellulose)
Coloration des protéines par le bleu de coomassie du gel d’acrylamide
Mise en évidence des protéines phosphorylées sur la nitrocellulose Anticorps anti-anticorps anti-phosphoprotéines nitrocellulose Anticorps anti-phosphoprotéines Les seconds anticorps portent une enzyme (péroxidase) qui au contact du substrat
Résultats sur le film autoradiographique CD4 TCR - + PM