Approches méta-génomiques

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1 Approches méta-génomiques
en Microbiologie Pascal SIMONET Ecologie Microbienne, Univ. Lyon1-CNRS Laboratoire Ampère, ECL-CNRS

2 CONTEXTE

3 Microorganismes Eucaryotes microscopiques Procaryotes
Whitman et al PNAS, 95, Prokaryotes: The unseen majority. 4-6 x 1030 cellules bactériennes 1,2 x Océan 2,6 x Sol 3,5 x Sol profond 0,25 - 2,5 x Sous sol océanique

4 The diversity of life

5 Overview Microbes dans l’environnement
Microorganismes (bactéries, archaea, champignons, levures) colonisent tous les écosystèmes de notre planète. Un gramme de sol de jardin > cellules microbiennes (100 – 1000 espèces différentes). Le corps humain: 1 milliard de cellules microbiennes. Microorganismes: impliqués dans tous les processus globaux Microorganismes: Rôle fondamental en Biotechnologie (e.g., antibiotiques, fermentation, expression, bioremédiation).

6 Despite temperatures ranging from –5 to –70oC and
water contents below 2%, Antarctic terrestrial soils contain 106 – 108 cells per gram.

7 Large populations of hyperthermophilic bacteria and archaea
live in boiling hydrothermal systems.

8 Culture in vitro Approches traditionnelles en microbiologie
Collections de microorganismes: - Laboratoires académiques - Organisations privées ou publiques ATTC (USA) LMG (Belgique) DSM (Allemagne) I. Pasteur (France) - Laboratoires industriels

9 Isolats bactériens Problèmes d’identification
Problèmes de caractérisation Problèmes de taxonomie Problèmes d’évolution (transferts latéraux de gènes) Problèmes d’accessibilité Problèmes de représentativité (1% de cultivés) Problèmes de conservation Problèmes de criblage

10 PRINCIPE Approches « métagénomiques » en microbiologie
ADN microbien « environnemental ». Extraction, Purification, Exploitation Identification, caractérisation, fonctions et exploitation des bactéries non cultivées.

11 Lyse in situ et extraction directe de l’ADN (total), purification.
Extraction des cellules bactériennes, purification, lyse, purification de l’ADN. Source ? Sélection PCR: Banques de séquences 16S rDNA. Clonage direct: Banques d’ADN métagénomique Séquençage direct

12 Banque d’ADN métagénomique
Extraction d’ADN des bactéries (métagénome) Clonage Transformation dans hôte cultivable ADN métagénomique vecteur Banque d’ADN métagénomique Séquençage direct (shotgun) PCR Culture in vitro Clonage séquençage RISA, T-RFLP DGGE Criblage moléculaire Criblage chimique Criblage biologique Détection de gènes par hybridation Détermination de la structure chimique des molécules produites Isolement in vitro de bactéries cultivables Phylogénie Estimation de la diversité bactérienne (17) Caractérisation Comparaison de différentes situations environnementales Détection directe d’activité antibactérienne ou enzymatique

13 Création et exploitation de banques d’ADN métagénomique
Renaud NALIN 3 rue des Satellites Toulouse Création et exploitation de banques d’ADN métagénomique

14 ATOUTS et LIMITES

15 Génomique: Définition
C'est l'étude exhaustive des génomes et en particulier de l'ensemble des gènes, de leur disposition sur les chromosomes, de leur séquence, de leur fonction et de leur rôle. Séquençage massif, Méthodes bio-informatiques Post-génomique Sciences en « iques », transcriptomique, protéomique, métabolomique etc…

16 « Méta -génomique » en Microbiologie ??
Sensu stricto non, mais… Sensu lato Utilisation de l’ADN oui

17 Eaux de drainage des mines de fer
Couverture par banque d’ADN métagénomique de 80 x106 pb ( clones) Génome quasi complet Leptospirillum sp. et Ferroplasma sp. et le Génome partiel de 3 autres bactéries. Tyson GW et al. (2004) Nature 428, 37-43

18 Eaux de drainage des mines de fer
Couverture par banque d’ADN métagénomique de 80 x106 pb ( clones) Génome quasi complet Leptospirillum sp. et Ferroplasma sp. et le Génome partiel de 3 autres bactéries. Tyson GW et al. (2004) Nature 428, 37-43 Sols cultivés ou forestiers: 109 cellules par gramme 10 000 espèces génomiques dominantes différentes 9 millions de clones (pour des inserts moyens de 40 kb) nécessaires pour un représentant de chaque espèce. Banque métagénomique d’un sol de prairie ( clones) Taille totale de l’ADN cloné : 3,5 x 109 pb 5% de la diversité totale (x24 /techniques de culture) Ginolhac A et al. (2003) Appl Environ Microbiol 70,

19 Extraction et purification de l’ADN environ.
Frostegard A., Courtois S., Ramisse V., Clerc S ., Bernillon D., Le Gall F., Jeannin P., Nesme X. and Simonet P Quantification of Bias Related to the Extraction of DNA Directly from Soils. Appl. Environ. Microbiol., 65 : Lyse cellulaire ?? Taux de récupération de l’ADN ??

20 APPLICATIONS

21 Banque d’ADN métagénomique
Extraction d’ADN des bactéries (métagénome) Clonage Transformation dans hôte cultivable ADN métagénomique vecteur Banque d’ADN métagénomique Séquençage direct (shotgun) PCR Culture in vitro Clonage séquençage RISA, T-RFLP DGGE Criblage moléculaire Criblage chimique Criblage biologique Détection de gènes par hybridation Détermination de la structure chimique des molécules produites Isolement in vitro de bactéries cultivables Phylogénie Estimation de la diversité bactérienne (17) Caractérisation Comparaison de différentes situations environnementales Détection directe d’activité antibactérienne ou enzymatique

22 Criblage moléculaire d’une banque d’ADN métagénomique
par hybridation de colonies Criblage moléculaire

23 Type I PKS (PKSI) La structure des polyketides produits par les PKSI est liée à leur organisation linéaire en domaines et modules.

24 Sol Criblage de banques d’ADN métagénomique (sol)
clones « KS » +++ 40 « KS » séquencés Pas de redondance Nouveauté totale (similarité < 67%) Ginolhac A., Jarrin C., Gillet B., Robe P., Pujic P., Tuphile K., Bertrand H., Vogel T. M., Perriere G., Simonet P., and Nalin R 2004. Phylogenetic Analysis of Polyketide Synthase I Domains from Soil Metagenomic Libraries Allows Selection of Promising Clones. Appl. Environ. Microbiol. 2004;

25 Banque d’ADN métagénomique
Extraction d’ADN des bactéries (métagénome) Clonage Transformation dans hôte cultivable ADN métagénomique vecteur Banque d’ADN métagénomique Séquençage direct (shotgun) PCR Culture in vitro Clonage séquençage RISA, T-RFLP DGGE Criblage moléculaire Criblage chimique Criblage biologique Détection de gènes par hybridation Détermination de la structure chimique des molécules produites Isolement in vitro de bactéries cultivables Phylogénie Estimation de la diversité bactérienne (17) Caractérisation Comparaison de différentes situations environnementales Détection directe d’activité antibactérienne ou enzymatique

26 Pseudomonas fluorescens
Hôtes d'expression Streptomyces coelicolor Vecteurs Escherichia coli Bacillus subtilis Pseudomonas fluorescens

27 Développement de vecteurs navettes
Banques d’ADN métagénomique ou Hôtes d'expression? Criblage chimique Développement de vecteurs navettes A second generation snp-derived Escherichia coli–Streptomyces shuttle expression vector that is generally transferable by conjugation Nikodinovic, Priestley, Plasmid 56 (2006) 223–227

28 Banque d’ADN métagénomique
Extraction d’ADN des bactéries (métagénome) Clonage Transformation dans hôte cultivable ADN métagénomique vecteur Banque d’ADN métagénomique Séquençage direct (shotgun) PCR Culture in vitro Clonage séquençage RISA, T-RFLP DGGE Criblage moléculaire Criblage chimique Criblage biologique Détection de gènes par hybridation Détermination de la structure chimique des molécules produites Isolement in vitro de bactéries cultivables Phylogénie Estimation de la diversité bactérienne (17) Caractérisation Comparaison de différentes situations environnementales Détection directe d’activité antibactérienne ou enzymatique

29 Environnement marin Venter et al. 2004.
Environmental Genome Shotgun Sequencing of the Sargasso Sea. Science 304, 1800 espèces génomiques 148 phylotypes bactériens inconnus

30 Nucleic Acids Research, 2006, Vol. 34, No. 19 5623–5630
Bioinfo MetaGene: prokaryotic gene finding from environmental genome shotgun sequences Hideki Noguchi*, Jungho Park and Toshihisa Takagi Department of Computational Biology, Graduate School of Frontier Sciences, University of Tokyo, Kashiwa, Chiba , Japan MetaGene can predict a whole range of prokaryotic genes based on the anonymous genomic sequences of a few hundred bases, with a sensitivity of 95% and a specificity of 90% for artificial shotgun sequences (700 bp fragments from 12 species).

31 Banque d’ADN métagénomique
Extraction d’ADN des bactéries (métagénome) Clonage Transformation dans hôte cultivable ADN métagénomique vecteur Banque d’ADN métagénomique Séquençage direct (shotgun) PCR Culture in vitro Clonage séquençage RISA, T-RFLP DGGE Criblage moléculaire Criblage chimique Criblage biologique Détection de gènes par hybridation Détermination de la structure chimique des molécules produites Isolement in vitro de bactéries cultivables Phylogénie Estimation de la diversité bactérienne (17) Caractérisation Comparaison de différentes situations environnementales Détection directe d’activité antibactérienne ou enzymatique

32 Gènes de résistance au nickel
Sol (extrême) Gènes de résistance au nickel Modèle : Déblais de mines de nickel en Nouvelle-Calédonie Fortes teneurs en métaux lourds « Sols » chimiquement déséquilibrés Ni Cr, Co, C, N, P … Carence en éléments essentiels Fall, Herrera, Helassa, Bernillon, Simonet, Vogel, Navarro

33 Taille des fragments : 2-9Kb Taille des fragments : 20-40Kb
Banques plasmidiques Banques cosmidiques Taille des fragments : 2-9Kb Taille des fragments : 20-40Kb 8 mM 8 mM 2 clones MS1 et MS2 3 clones MS3, MS7 et MS43

34 ORFs impliqués dans la résistance au nickel :
MS3 10 1 ORF1 ORF2 ATPase E1-E2 nreA nreB HP HP RT MS7/43 8 1 chrA chrB NicO DedA nreB rcnA nreA ORF1 ORF2 wcaK ORFs impliqués dans la résistance au nickel : nreB - rcnA

35 Environnement humain Determining the antibiotic resistance potential of the indigenous oral microbiota of humans using a metagenomic approach Diaz-Torres et al FEMS Microbiol Lett 258, 257–262 Bouche: Prévalence de nombreux gènes de résistance aux antibiotiques

36 Animal Fosses océaniques Marin
Symbiosis insights through metagenomic analysis of a microbial consortium Woyke et al. 2006, Nature Vol 443, 26 October 2006 Olavius algarvensis, (vers marin) Microsymbiontes remplacent bouche et tube digestif Animal Microbial diversity in the deep sea and the underexplored ‘‘rare biosphere’’ Sogin et al. 2006, PNAS vol no –12120 Grande profondeur: Complexité jusqu’à 2 ordres de grandeur > autres environnements. Des milliers de populations faiblement représentées Fosses océaniques Metagenomic Analysis of Coastal RNA Virus Communities Culley et al. 2006, SCIENCE VOL JUNE 2006 Océans: un réservoir de virus à ARN inconnus Marin

37 Méta-génomique comparative
22 APRIL 2005 VOL 308 SCIENCE Comparative Metagenomics of Microbial Communities Tringe,1,2* von Mering,3* Kobayashi,1 Salamov,1 Chen,4 Chang,5 Podar,5 Short,5 Mathur,5 Detter,1 Bork,3 Hugenholtz,1 Rubin1,2. 1Department of Energy (DOE) Joint Genome Institute, 2800 Mitchell Drive, Walnut Creek, CA 94598, USA. 2Lawrence Berkeley National Laboratory, Genomics Division, Berkeley, CA 94720, USA. 3European Molecular Biology Laboratory, Meyerhofstrasse 1, Heidelberg, Germany. 4University of California, Berkeley, Department of Electrical Engineering and Computer Science, Berkeley, CA 94720, USA. 5Diversa Corporation, 4955 Directors Place, San Diego, CA 92121, USA « The identification of environment-specific genes through a gene-centric comparative analysis presents new opportunities for interpreting and diagnosing environments. »

38 Gut Feb;55(2): Tube digestif Reduced diversity of faecal microbiota in Crohn's disease revealed by a metagenomic approach. C Manichanh, L Rigottier-Gois, E Bonnaud, K Gloux, E Pelletier, L Frangeul, R Nalin, C Jarrin, P Chardon, P Marteau, J Roca and J Dore INRA, Genoscope, Genopôle IP, LibraGen etc Six healthy donors and six patients with CD. Bacterial diversity (16S rRNA gene). A reduced complexity of the bacterial phylum Firmicutes as a signature of the faecal microbiota in patients with CD. Presence of new bacterial species.

39 Applications méta-génomique?
ADN environ. Ecologie µbienne Environ. Détecter, identifier, localiser, compter les µorganismes. Identifier des gènes / Déterminer des activités potentielles. Exploiter des ressources génétiques.

40

41 Analyse génomique Improved inverse PCR scheme for metagenome walking
BioTechniques 41: (August 2006) Analyse génomique Improved inverse PCR scheme for metagenome walking Taku Uchiyama and Kazuya Watanabe Marine Biotechnology Institute, Kisarazu, Japan