High diversity of Rhodobacterales in

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1 High diversity of Rhodobacterales in
Bordeyne François Arias Ruiz Camilo Etude de publications High diversity of Rhodobacterales in the subarctic North Atlantic Ocean and gene agent transfer protein expression in isolated strains Fu Y, MacLeod DM, Rivkin RB, Chen F, Buchan A, Lang AS 2010 500 nm Jannaschia sp. CCS1 Terre-Neuve Marie Beauchamp Diversité des Organismes Marins UE 106

2 Présence d’Agents de Transfert de Gènes (ou GTAs)
Introduction Diversité Expression g5 Discussion Critique Conclusion Procaryotes : Organismes majeurs de l’océan 500 nm Jannaschia sp. CCS1 Ruegeria sp. TM1040 500 nm Rhodobacterales : Classe des alphaprotéobactéries 1 famille et 26 genres Importance dans la communauté du bactérioplancton Role écologique majeur ! Pourcentage de Rhodobacterales 10 20 30 40 50 60 800 600 400 200 Profondeur (m) Bloom Nord Atl. Ocean Pacifique côtier Mer Méditerranée Buchan et al., 2005 Présence d’Agents de Transfert de Gènes (ou GTAs) Biers et al., 2008 50 nm GTAs chez Ruegeria pomeroyi DSS-3

3 GTAs : Que sont-ils et quel est leur rôle ?
Introduction Diversité Expression g5 Discussion Critique Conclusion GTAs : Que sont-ils et quel est leur rôle ? Petites particules : environ 50 à 70 nm semblables à des bactériophages Transferts de parties de génomes entre bactéries Environ 4,5 kb GTA chez Reugeria mobilis 45A6 50 nm McDaniel et al. 100 nm Bactériophage lambda Schnos Rôle : flux majeur de gènes : adaptations aux conditions environnementales => Rôle écologique majeur

4  Marqueur Introduction Diversité Expression g5 Discussion Critique
Conclusion Mise en évidence de 3 gènes : g2 : protéine terminase g5 : protéine majeur de la capside g9 : protéine majeure de la queue g5 : protéine majeur de la capside  Marqueur Cluster GTA 1 kb 10 kb g2 g5 g9 CysE chp recG Lang et Beatty, 2000, modifié Avantage : conservation des séquences Objectifs Estimation de la diversité en Rhodobacterales de la communauté bactérienne Etude de l’expression de la protéine g5 chez différentes souches/espèces

5 Lieu de prélèvements Introduction Diversité Expression g5 Discussion
Critique Conclusion 1000 km USA Groenland Canada Terre Neuve Pickatrail ® Lieu de prélèvements N 10 km Google Earth, U.S. Navy N

6 Été Hiver Total Chesapeake
Introduction Diversité Expression g5 Discussion Critique Conclusion Rhodobacter capsulatus Ordre du µm Matériel et méthodes Phylogénie selon méthode de Neighbor-Joining  Séquence g5 Création d’OTUs  97 % d’identité nucléotidique Résultats Paramètres Été Hiver Total Chesapeake Nombre Clones 127 45 172 158 Nombre d’OTUs 54 10 59 12 Indice de Shannon H’ 3,71 1,59 - H’ max = 2,39 Identité nucléotidique inter-OTUs : 44 – 97 % Diversité supérieure en été

7 Echelle non représentative
Introduction Diversité Expression g5 Discussion Critique Conclusion Octadecabacter antarcticus 307 Octadecabacter Ete Hiver Loktanella sp. CCS2 Loktanella Oceanibulbus indolifex HEL-45 Oceanibulbus Sulfitobacter sp. EE-36 Sulfitobacter sp. NAS-14.1 Sulfitobacter Sulfitobacter Oceanibulbus Roseobacter denitrificans OCh114 Octadecabacter Loktanella Ruegeria pomeroyi DSS-3 Roseobacter sp. MED193 Rhodobacter capsulatus SB1003 Citreicella sp. SE45 Groupe externe Echelle non représentative Fu et al., 2010 modifié

8 Echelle non représentative
Introduction Diversité Expression g5 Discussion Critique Conclusion Sulfitobacter sp. EE-36 Sulfitobacter sp. NAS-14.1 Oceanibulbus indolifex HEL-45 Roseobacter denitrificans OCh114 Octadecabacter antarcticus 307 Loktanella sp. CCS2 Rhodobacterales bacterium HTCC2150 Ruegeria pomeroyi DSS-3 Phaeobacter sp. Y4I Roseobacter sp. MED193 Rhodobacter capsulatus SB1003 Groupe externe Citreicella sp. SE45 Sulfitobacter Echelle non représentative Oceanibulbus Octadecabacter Loktanella Fu et al., 2010 modifié

9 Echelle non représentative
Introduction Diversité Expression g5 Discussion Critique Conclusion Matériel et méthodes Echelle non représentative Western blot DML-w6 DML-w13 DML-w12.1 DML-w4.2 DML-w8 Sulfitobacter sp. NAS-14.1 Roseobacter sp. GAI101 Oceanilbulbus indolifex HEL-45 Octadecabacter antarcticus 307 CB1023 CB1005 CB1040 Loktanella sp. CCS-2 Citreicella sp. SE45 Roseovarius sp. HTCC2601 Ruegeria pomeroyi DSS-3 Phaeobacter sp. Y4I Rhodobacter capsulatus SB1003 Roseobacter sp. MED193 10 souches/espèces testées + 3 témoins 5 provenant de Terre-Neuve 3 provenant de la baie de Chesapeake 2 autres Poids moléculaire :  g5 mature chez Rhodobacter capsulatus Fu et al., 2010 modifié

10 Echelle non représentative
Introduction Diversité Expression g5 Discussion Critique Conclusion kDa 46 30 Rc g5- 4.2 6 8 12.1 13 DSS Y41 SE 05 23 40 Fu et al., 2010 Résultats Echelle non représentative DML-w6 DML-w13 DML-w12.1 DML-w4.2 DML-w8 Sulfitobacter sp. NAS-14.1 Roseobacter sp. GAI101 Oceanibulbus indolifex HEL-45 Octadecabacter antarcticus 307 CB1023 CB1005 CB1040 Loktanella sp. CCS-2 Citreicella sp. SE45 Roseovarius sp. HTCC2601 Ruegeria pomeroyi DSS-3 Phaeobacter sp. Y4I Rhodobacter capsulatus SB1003 Roseobacter sp. MED193 Expression de la protéine dans 60 % des cas (6/10) 4/5 pour les échantillons de Terre-Neuve 2/3 pour ceux de la baie de Chesapeake 0/2 pour Loktanella Protéines matures Fu et al., 2010 modifié

11 Bloom phytoplanctonique, Terre Neuve
Introduction Diversité Expression g5 Discussion Critique Conclusion Diversité Mer de Weddel, Antarctique Jean-Pierre Marro Adaptation aux environnements froids Terre Neuve : de -1,5 à 16°C Baie de Chesapeake : de 1 à 26 °C Période du bloom phytoplanctonnique 50 km N Bloom phytoplanctonique, Terre Neuve Terre Neuve : mi Avril à fin Mai Baie de Chesapeake : fin Février à fin Mars Existence de microdiversité Nouveaux groupes = nouvelles caractéristiques écologiques ? NASA

12 Expression g5 Introduction Diversité Expression g5 Discussion Critique
Conclusion Monsieurben, modifié Expression g5 Possibilité d’aucune expression Mais aussi : Mauvaises conditions de croissance Seuil de détection trop élevé 50 nm McDaniel et al. g5 mature  formation du GTAs Acquisition de nouvelles caractéristiques : dégradation de molécules carbonées ou soufrés particulières, etc.

13 Introduction Diversité Expression g5 Discussion Critique Conclusion
Une autre évidence Conservation de la zone de clivage très importante GLRGLSLEGKALNSAVAAEG GLRGLELEGKAMSTAVAGDG GLRGLVLEGKALSTAVAGDG ALRGLELEGKSLSSAVAADG ALRGLTLEGKAMSTAINSDG GLRGLELDSKSMSTAVNSDG Rhodobacter capsulatus SB1003 Oceanibulbus indolifex HEL-45 Phaeobacter sp. Y4I Citreicella sp. SE45 Octodecabacter antarcticus 307 Ruegeria pomeroyi DSS-3 Zone de clivage Fu et al., 2010

14  Suivi de l’évolution de la communauté en Rhodobacterales
Introduction Diversité Expression g5 Discussion Critique Conclusion Phylogénie g5 vs phylogénie ARNr 16S : non congruence Europe 1  Originalité du marqueur Temps écoulé entre les 2 prélèvements  Rhodobacterales affectées par une eau contaminée 12/08/2002 Terre-Neuve N Mise en évidence de bloom phytoplanctonnique estival par la NASA  Suivi de l’évolution de la communauté en Rhodobacterales NASA

15 Introduction Diversité Expression g5 Discussion Critique Conclusion
Seulement 2 prélèvements, sans réplicats  Comparaisons + diminution du risque d’extrêmes 10 km Google Earth, U.S. Navy N Difficulté de culture des souches/espèces Labrot © Vitesse d’évolution de la séquence g5

16 Diversité en Rhodobacterales importante à Terre Neuve
Introduction Diversité Expression g5 Discussion Critique Conclusion Diversité en Rhodobacterales importante à Terre Neuve Mise en évidence d’une nouvelle partie de la grande diversité de cet ordre 500 nm 500 nm Expression de protéines g5 matures chez plusieurs espèces Ordre du µm  Transferts et acquisition de gènes peuvent être réalisés 10 20 60 50 40 30 140 120 100 80 Nombre d’OTUs Nombre de clones Eté Hiver Fu et al., 2010 modifié 50 nm Mais, de nombreux travaux restent à effectuer pour en connaitre encore et encore…

17 Bibliographie Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. Second edition. Volume 2 : The Proteobacteria. Part c : The Alpha-, Beta-, Delta- and Epsilonproteobacteria. (2005) Biers EJ, Wang K, Pennington C, Belas R, Chen F, Moran MA (2008) Occurrence and Expression of Gene Transfer Agent Genes in Marine Bacterioplankton. Applied and environmental microbiology : 2933 – 293 Buchan A, Gonzalez JM, Moran MA (2005) Overview of the marine Roseobacter lineage. Appl Environ Microbiol 71: 5665 –5677 Ettema TJG et Andersson SGE (2009) The α-proteobacteria: the Darwin finches of the bacterial world. Biol. Lett. (5): Fu Y, MacLeod DM, Rivkin RB, Chen F, Buchan A, Lang AS (2010) High diversity of Rhodobacterales in the subarctic North Atlantic Ocean and gene transfer agent protein expression in isolated strains. Aquat Microb Ecol : Lang AS et Beatty JT (2000) Genetic analysis of a bacterial genetic exchange element: The gene transfer agent of Rhodobacter capsulatus. PNAS (97) : 859 –864 Prabagaran SR, Manorama R, Delille D, Shivaji S (2007) Predominance of Roseobacter, Sulfitobacter, Glaciecola and Psychrobacter in seawater collected off Ushuaia, Argentina, Sub-Antarctica. FEMS Microbiol Ecol 59 : 342–355 Zhao Y, Wang K, Budinoff C, Buchan A, Lang A, Jiao N, Chen F (2009) Gene transfer agent (GTA) genes reveal diverse and dynamic Roseobacter and Rhodobacter populations in the Chesapeake Bay. The ISME journal (3) : Google Earth (Version 6.0) [Software]. Mountain View, CA: Google Inc. (2010). Disponible sur NASA Earth Observatory (2010) Phytoplankton bloom off Newfoundland. Novembre 2010

18 Merci de votre attention !
Terre-Neuve

19 High diversity of Rhodobacterales in
Bordeyne François Arias Ruiz Camilo Etude de publications High diversity of Rhodobacterales in the subarctic North Atlantic Ocean and gene agent transfer protein expression in isolated strains Fu Y, MacLeod DM, Rivkin RB, Chen F, Buchan A, Lang AS 2010 500 nm Jannaschia sp. CCS1 Terre-Neuve Marie Beauchamp Diversité des Organismes Marins UE 106

20 Questions Cycles de PCR et primers utilisés Pour la séquence g5
30 s à 98 °C puis 35 cycles de 10 s à 98 °C, 30 s à 60 °C et 30 s à 72 °C, avec pour finir 7 min à 72 °C Primers : MCP-109F : 5’-GGC TAY CTG GTS GAT CCS CAR AC-3’ MCP-368R : 5’-TAG AAC AGS ACR TGS GGY TTK GC-3’ Pour la séquence ADNr 16S Cycle : 30 s à 98 °C puis 35 cycles de 10 s à 98 °C, 30 s à 58 °C et 30 s à 72 °C, avec pour finir 8 min à 72 °C Primers : 27F : 5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’ 1522R : 5’-AAG GAG GTG ATC CAN CCR CA-3’

21 Base azotée : abréviations
Base ou type de bases code à une lettre Adénine A Thymine T Guanine G Cytosine C Inosine I Uracile U Purine : Adénine ou Guanine R Faible liaison (deux liaisons hydrogène) : Adénine ou Thymine W Fonction cétone dans le grand sillon de l'ADN : Thymine ou Guanine K Pas une Adénine B Pas une Thymine V Pyrimidine: Thymine ou Cytosine Y Forte liaison (trois liaisons hydrogène) : Cytosine ou Guanine S Fonction amine dans le grand sillon de l'ADN : Adénine ou Cytosine M Pas une Cytosine D Pas une Guanine H Quelconque N

22 Anticorps du g5 Anticorps polyclonal dirigé contre un peptide synthétique correspondant à une région de la protéine majeure capsid (g5) GTA conservée à plus de 90 %. Détection de la présence d'une protéine dans un tissu, évaluation de la taille et la concentration. Avantage Expérience de neutralisation d'anticorps Pour confirmer la détection des bandes spécifiquement reconnues par les anticorps primaires du GTA. Anticorps primaire Anticorps Control (Non neutralisé) Incubé avec un excès molaire (~100 plis du peptide d'immunisation) 2h en solution buffer (TBST) à T° ambient. Meme conditions sans adition de peptide TBST Tris-Buffered Saline Tween-20

23 Pourcentage de recouvrement
C = 1 – (N/n) x 100 N : nombre de séquences uniques n : nombre total de clones But : calculer la proportion de la diversité entre les séquences Analyse de raréfaction Cette analyse permet d’estimer le nombre d’espèces présentent dans un échantillon à partir du nombre total d’individus.

24 Mécanisme de transfert de gènes chez les procaryotes
Conjugaison Transformation bactérienne

25 Neighbor Joining Méthode d’analyse phénétique
But : établir les relations phylogénétiques entre différents taxons, à partir d’un indice de distance Obtention d’un arbre non raciné N’accepte pas l’exactitude de l’horloge moléculaire Ici : méthode des distances  the Maximum Composite Likelihood Method

26 Taille moyenne des différentes structures
Bactérie : 2 µm Cellule eucaryote : 20 µm GTA : 50 – 70 nm

27 Position des alphaprotéobactéries dans le vivant
Archae Eucaryotes Bactéries γ-protéobactéries β-protéobactéries α-protéobactéries ε-protéobactéries Cyanobactéries Firmicutes Planctomycètes Spirochètes Actinobactéries

28 Western blot Permet d’étudier la synthèse (ou non) de protéine
 utilisation de sonde : des anticorps Northern blot : permet de quantifier l’expression du gène Southern blot : permet de répondre à combien de gènes sont exprimés

29 H’ = - ∑ pi ln(pi) Indice de Shannon H’ 0 < H’ < ln S
i = Espèce du milieu pi = proportion de l’espèce I dans le milieu S = nombre d’espèces dans le milieu Mesure de la diversité d’un milieu. Plus H’ est grand, plus la diversité est importante. L’indice est max quand toutes les espèces sont à égale proportion Source : Grall J. et Hily C.

30 Roseobacter vs Rhodobacterales
Loktanella Octadecabacter - Ruegeria Sulfitobacter - Oceanibulbus Roseobacter Ruegeria Rhodobacter capsulatus Buchan et al., 2005

31 ORF : Open Reading Frames
Séquence d’ADN qui permet d’estimer la présence d’un gène Commence par un codon d’initiation et termine par un codon stop. Entre ces codons, on retrouve les codons codant pour la protéine  la partie codante de l’ADN

32 Correspondance Acides aminés/abbréviations
ACIDE AMINE 3 lettres 1 lettre Codons Alanine Ala A GCA, GCC, GCG, GCT Arginine Arg R CGA, CGC, CGG, CGT, AGA, AGG Aspartic acid Asp D GAC, GAT Asparagine Asn N AAC, AAT Cysteine Cys C TGC, TGT Glutamic acid Glu E GAA, GAG Glutamine Gln Q CAA, CAG Glycine Gly G GGA, GGC, GGG, GGT Histidine His H CAC, CAT Isoleucine Ile I ATA, ATC, ATT Leucine Leu L CTA, CTC, CTG, CTT, TTA, TTG Lysine Lys K AAA, AAG Methionine Met M ATG Phenylalanine Phe F TTC, TTT Proline Pro P CCA, CCC, CCG, CCT Serine Ser S TCA, TCC, TCG, TCT, AGC, AGT Threonine Thr T ACT, ACC, ACG, ACT Tryptophan Trp W TGG Tyrosine Tyr Y TAC, TAT Valine Val V GTA, GTC, GTG, GTT STOP - TAG, TAA, TGA

33 Position phylogénétique non sûre
En se basant sur l’ARNr 16S, Lee et al., proposent une taxonomie différente de celle du Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. This study BMSB Order Caulobacterales Family Caulobacteraceae Family Hyphomonadaceae Order ‘Rhodobacterales’ Family ‘Rhodobacteraceae’ The hierarchical system of the ‘Alphaproteobacteria’: description of Hyphomonadaceae fam. nov., Xanthobacteraceae fam. nov. and Erythrobacteraceae fam. nov. Lee et al., 2005