STABILITE DES ACYLCARNITINES Sang total (Guthrie) C Acquaviva G Briand Paris, le 11/01/2016 BIOLOGIE & QUALITE N°3, le 11 janvier 2016.

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1 STABILITE DES ACYLCARNITINES Sang total (Guthrie) C Acquaviva G Briand Paris, le 11/01/2016 BIOLOGIE & QUALITE N°3, le 11 janvier 2016

2 COMPARAISON DES ACYLCARNITINES Sang total (Guthrie) Pour différents types de prélèvements : Héparine,EDTA,tube sec Sang total déposé sur papier Guthrie 2 prélèvements de Lille 2 prélèvements de Lyon

3 Lyon Lille Comparaison differents types de prélèvement sur papier Guthrie Pas de variations de +/- 20 % communes aux 2 labos Prélèvement héparine =référence

4 Sang total déposé sur papier Guthrie À differents temps : T0, T1h,T2h,T3h,T5h,T7h,T24h,T48h Conservation sang total à T° ambiante et +4°C puis acylcarnitines Guthrie-Lille Valeur minimum prise en considération : 0.1 µM

5 Conservation sang total à 4°C puis acyl guthrie - Lille Conservation sang total à T° amb puis acyl Guthrie (Lille) T ambiante diminution d’acylcarnitines à longue chaine: C16, C18:2 Augmentation de l’acetylcarnitine à partir de 7h 4°C Aucune diminution d’acylcarnitines en 48h Augmentation de l’acetylcarnitine à partir des 24h T0 1h 2h 3h 5h 7h 24h 48h

6 STABILITE DES ACYLCARNITINES Sang total (Guthrie) Conservation à T° ambiante

7 I) 1CPT1, 2CPT2, 2 MMA, 3 HMG CoA Lyase, 1 acidémie propionique, 3 GA1, 1beta cetothiolase, 1 LCHAD, 3 VLCAD, 3MCAD, 1 acidémie isovalérique,1 cas non diagnostiqué Comparaison résultats Novembre 2015 /Année 2011 soit 4 ans en moyenne 1460 jours sur 22 prélèvements Guthrie Valeur minimum prise en considération : 0.1 µM II ) Analyse d’une VLCAD après conservation à différents temps: 1650 J, 1020J, 900J, 510 J, 360J, 180J Valeur minimum prise en considération: 0.1µM Analyse des acylcarnitines sur Guthrie conservé à T° ambiante

8 nombre % variation 2015/2011Ecart-typeCVPlus bassePlus haute C16:110-39,212,0-30,6-56,3-20,0 C1622-40,68,0-19,8-55,0-25,0 C16:1OH5-33,42,4-7,3-36,4-30,0 C16OH2-69,032,0-46,3-91,7-46,4 C18:217-32,412,8-39,5-50,0-8,1 C18:122-36,912,3-33,3-61,5-15,4 C1821-27,910,4-37,3-48,4-12,7 C18:1OH1-38,9 C18OH1-44,9 C6DiCOOH6-41,624,9-59,7-64,0-7,7 C8DiCOOH3-57,16,2-10,9-61,5-50,0 C10DiCOOH7-38,524,7-64,2-63,611,1 C12DiCOOH2-22,76,4-28,3-27,3-18,2 C4OH4-65,437,4-57,2-91,9-10,0 Malonylcarn5-44,717,6-39,3-55,0-13,6 C12:12-58,87,7-13,2-64,3-53,3 nombre % variation 2015/2011Ecart-typeCVPlus bassePlus haute C02244,327,862,89,3122,4 C222-51,821,8-42,0-80,28,9 C322-86,17,2-8,4-93,4-58,9 C416-60,39,6-16,0-72,7-37,5 C5:13-42,717,8-41,7-58,3-23,3 C515-23,416,0-68,5-52,611,1 C66-46,125,5-55,2-66,00,0 C5OH+HMB15-33,113,5-40,7-50,00,0 C8:16-58,09,1-15,7-66,7-46,2 C89-51,79,3-17,9-64,7-37,1 C10:16-45,928,7-62,5-73,20,0 C1012-43,210,3-23,9-63,2-22,0 MMA21-76,67,8-10,2-84,6-53,8 Glut4-81,48,1-10,0-90,4-70,8 C125-35,017,6-50,3-50,0-5,3 MeGlut5-38,025,9-68,2-64,0-7,7 C14:221796,6667,183,7-53,82000,0 C14:17-40,610,7-26,2-53,5-29,4 C1411-38,110,4-27,3-60,0-27,8 C14OH1-50,0 Etude des 22 Guthrie 20152011diff%diff 195,44184,211,246,1 205,13239,77-34,64-14,4 46,655,3-8,7-15,7 69,2689,69-20,43-22,8 60,664,06-3,46-5,4 36,5743,64-7,07-16,2 46,6254,61-7,99-14,6 63,3474,28-10,94-14,7 63,4865,6-2,12-3,2 44,0544,79-0,74-1,7 45,2548,55-3,3-6,8 39,7541,02-1,27-3,1 16,6417,71-1,07-6,0 54,2954,49-0,2-0,4 28,7631,3-2,54-8,1 31,833,34-1,54-4,6 68,1164,573,545,5 19,3121,02-1,71-8,1 59,9557,82,153,7 45,9942,853,147,3 41,4945,29-3,8-8,4 96,5299,62-3,1 Variation (de 2011 à 2014) pour chaque Acylcarnitine à T° ambiante Variation de 2011 à 2014 pour la carnitine totale (L + esterifiée) Diminution moyenne de 6 %

9 Comparaison résultats Novembre 2015 /Année 2011 soit 4 ans en moyenne 1460 jours sur 22 prélèvements Guthrie Variation Carnitine TOTALE = carn libre + acylcarn % de variation Moyenne : -6 % % de variation Variation des Differentes Acylcarnitines

10 mars-11dec 12avr-13mai-14nov-14avr-15 jours16501020900510360180 C097,231,3 9,3 17,0 16,53,7 C2-48,814,1- 8,7- 24,0- 24,73,4 C3-84,3-78,8- 85,6- 81,0- 73,3-75,2 C4-50,0-27,3- 30,8- 28,6- 16,7-20,0 C5:150,0 C5-33,3 - 9,1 C6-40,0 90,0 C5OH+HMB-25,022,2- 10,0- 21,4 11,1 C8:1-66,7 C8-40,0 C10:1-21,1 C10-22,0 - 45,5 MMA-62,5-59,4- 77,8- 48,0- 50,0-41,4 Glut-33,3 C12-5,3 MeGlut-64,0 C14:2-10,358,8 10,5 71,4 91,7-12,5 C14:1-29,9-40,0- 39,4- 9,1- 26,9-41,0 C14-34,4-26,9- 30,9- 18,2- 24,3-33,8 C14OH25,0 C16:1-42,3-31,8- 28,0 - 35,7-23,7 C16-38,0-20,4- 29,4- 18,5- 41,2-20,0 C16:1OH-33,3 C16OH-20,0 C18:2-11,4-9,5- 37,5- 43,8- 16,7-25,6 C18:1-17,9-35,4- 39,8- 26,5- 35,4-24,6 C18-15,1-12,3- 23,6- 20,3- 48,7-18,3 Analyse Acylcarnitine d’une VLCAD après conservation à T° ambiante à différents temps: 1650 J, 1020J, 900J, 510 J, 360J, 180J oct-15DELTA% DELTA mars-1144,0544,79-0,74-1,7 dec-1248,3841,86,5815,7 avr-1344,2245,85-1,63-3,6 mai-1438,4939,75-1,26-3,2 nov-1439,9442,09-2,15-5,1 avr-1539,1441,52-2,38-5,7 Analyse carnitine totale VLCAD aux mêmes temps

11 Analyse Acylcarnitine d’une VLCAD après conservation à T° ambiante à différents temps: 1650 J, 1020J, 900J, 510 J, 360J, 180J Variation moyenne -3.6%

12 STABILITE DES ACYLCARNITINES Sang total (Guthrie) Conservation à -20°C + dissécant Réalisé a partir d’un sang sur EDTA chargé en acylcarnitines

13 Conservation Guthrie à -20°C dans sachet avec dissécant Jours Lille Nancy

14 STABILITE DES ACYLCARNITINES Sang total (Guthrie) Etude bibliographique

15 R. Fingerhut Anal. Chem 81 N°9 2009 p 3571 Stabilité des acylcarnitines et carnitine libre sur Guthrie sanguin Sang total + ajout d’acylcarnitines : dépôt sur spots de 3.2 mm  Stockés à -18°C dans dessicateur: stabilité de la carnitine libre et acylcarnitines pendant au moins 330 jours  T° ambiante (18-25°C, 25-60% d’humidité) : 1000 jours o période >14 jours : acylcarnitines hydrolysées en carnitine libre et Acides gras correspondants o la vitesse de dégradation est logarithmique et longueur de chaine dépendante: les courtes chaînes s’hydrolysent plus vite que les longues

16 y =y 0 e -(b1t) + b2t R. Fingerhut Anal. Chem 81 N°9 2009 p 3571 Exemple de la propionylcarnitine

17 Conclusion acylcarnitines ½ vie selon R. Fingerhut et al % difference en 1500 jours (Notre experience) C3161-86% C4301-60% C5330-23% C6346-46% C8365-51% C10408-43% C12462-35% C14630-38% C16770-40% C18990-28% C0+ 44% C2-52% C14:1 C5DC-81.4% % diff en 180jours (Notre experience) -75% -20% -34% -20% -18% +3.7% -40%

18 Conclusion -Travaux de R. Fingerhut : Prélevements standardisés: sang total chargé en differentes acylcarnitines, puis dépôt sur papier Guthrie, sechage Conservation à temperature ambiante (18-25 °C, 25-60% humidité relative) -Notre expérience : dépôt et séchage non standardisés: Conclusion incluant les deux experiences  A -20°C les acylcarnitines sont stables au moins 330 jours  Si stockage à T° ambiante 1.Dès 14 jours, les acylcarnitines s’hydrolysent: diminution des acylcarnitines et augmentation de la carnitine libre [+ 44% en moyenne (9 à 120%) sur 4 ans] 2.La vitesse d’hydrolyse est logarithmique, dépendant de la longueur de chaine : les courtes chaines s’hydrolysent plus vite que les longueschaines

19 CONCLUSION: 3- Temps de conservation des acylcarnitines (notion de demie-vie) - demie-vie : 161 jours(C3) -990 jours (C18) : (R. Fingerhut ) dans des conditions idéales: C3,C4,C5,C6,C8,C10,C12,C14,C16,C18 -Attention en routine : conditions plus aléatoires. C3: attention quelquesoit la concentration : détection < 3 ans C5DC: probablement du même ordre sinon risque de manquer le diagnostic rétrospectivement Notre experience: (1MMA et 1 PA)/3 et 1 GA1 sur les 3 non diagnostiqués au bout de 4 ans C0= 44% (9%-122%) sur 4 ans C2: -51,8% (-80%- +9%) sur 4 ans

20 CONCLUSION: Recommandations sur prélèvements Guthrie - Prélèvement sang hépariné Guthrie mais possible EDTA, sang sans anticoagulant - Dépôt sang hépariné sur Guthrie dans les 3h (Tube à +4°C) - Conservation des Guthrie - Si possible conserver les Guthrie à -20°C dans sachet avec Dissécant : conservation 330 jours (R. Fingerhut et notre experience) - Conservation T°ambiante : Garder 100 jours comme temps demie-vie

21 Merci de votre attention C Acquaviva G Briand Paris, le 11/01/2016 BIOLOGIE & QUALITE N°3, le 11 janvier 2016