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Projet Créatinine Carole AMIOT, Farah BEN MIMOUN, Guillaume ELLENA, Marine MUGNIER, Margot PASTERNAK.

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1 Projet Créatinine Carole AMIOT, Farah BEN MIMOUN, Guillaume ELLENA, Marine MUGNIER, Margot PASTERNAK

2 Position du problème Les insuffisances rénales : ~ 3 millions de personnes o Les reins ne fonctionnent plus, certaines molécules ne sont pas évacuées. Détection actuelle : mesure de la créatinine o Molécule produite par le corps, et éliminée par les reins. Augmentation de sa concentration = dysfonctionnement rénal Mesure actuelle faite par des prises de sang régulières o Inconvénients : Invasif, problèmes à long termes, obligation de se rendre à lhôpital Enjeux du projet : o Trouver un moyen moins invasif de mesure : dans la salive 5/27/2010 Projet Créatinine

3 Créatinine Formule : C 4 H 7 N 3 O Produite par le corps à partir de la créatine o Taux constant, hors effort Dégradation par les reins et évacuation dans lurine o Concentration sanguine faible (30 mg/L) Concentration dans la salive = concentration sanguine Gamme de valeurs de concentration chez lhomme Sain Malade µmol/LFemme Homme Détection : Méthode de Jaffé : Créatinine + Acide picrique (jaune) pH alcalin Complexe jaune-orangé 5/27/2010 Projet Créatinine

4 But : le patient ne doit plus être obligé de se rendre à lhôpital pour faire les mesures Stratégie Utiliser une méthode de mesure par cinétique de réaction Tracer une courbe détalonnage : o Pente cinétique =f[Créatinine] Contraintes Quantité de salive à recueillir o ~5 mL pour létalonnage o ~100µL pour la mesure Présence dautres protéines dans la salive. Contenu propre à chacun o Courbe détalonnage personnelle Nécessité dun spectroscope (à étudier) 5/27/2010 Projet Créatinine

5 Plan daction Chercher une gamme de longueur dondes adaptées pour la mesure de DO Vérification du modèle cinétique de la réaction dans du tampon Vérification du bon déroulement de la réaction dans la salive o Présence dinterférents ? Gamme de concentrations de créatinine dans la salive Influence dautres paramètres o Variation du pH de léchantillon o Concentration de protéines dans léchantillon o Réaction parasite de la créatine o Contenu de la salive (Tests sur 2 personnes différentes) 5/27/2010 Projet Créatinine

6 Choix de la longueur donde Pour λ>490 nm, pas dinfluence de lacide picrique nayant pas réagi Pour λ>550nm, peu de signal dû au complexe coloré Pas de point où le réactif est visible et pas la créatinine 5/27/2010 Projet Créatinine Zone de travail

7 Projet Créatinine Linéarité des pentes : on pourra a priori utiliser cette méthode 28/05/10

8 Résultats et Méthodes Premiers résultats pas exploitables : problème de ratio Tests sur quelques tubes pour voir quel ratio est optimal : 80/120 Deuxième série de tests : ça marche ! Tests sur la salive artificiellement augmentée en concentration : ça marche! Prochains tests à faire : - test sur des patients avant et après traitement. - protéines qui influent (ajout BSA) - Tester si les réactifs réagissent avec la créatine EXPLIQUER LES RESULTATS, EXTRAIRE LA CINETIQUE

9 Tests avec la salive On réalise la même gamme de concentration que précedemment (0, 100, 120, 140, 200, 400, 600 et 800 µM) mais en remplaçant le tampon par de la salive. Il faut noter que la salive utilisée provient de sujets sains et qu'elle contient donc de la créatinine mais en faible quantité.

10 Premiers résultats dans la salive

11 Influence de la personne et de la longueur d'onde sur la courbe d'étalonnage

12 évolution cinétique et influence du spectromètre

13 Calcul de la constante cinétique

14 validation de la méthode Absence d'interférents notables à la réaction dans la salive mais nécessité d'établissement d'une courbe d'étalonnage propre à la personne

15 Quelques limitations influence de la personne observée en partie due à la quantité de créatinine présente dans la salive au départ différente pour les 2 personnes origines de l'erreur : - elle n'est calculée qu'à partir de 2 mesures - les échantillons de salive ont été prélevés à des moments différents (le matin après brossage de dents et après le repas de midi) - la salive n'a pas été filtrée et des dépôts dans certains puits ont faussé la mesure (ces données ont été retirées) l'influence de la température n'a pas été évaluée.

16 Résultats et Méthodes Premiers résultats pas exploitables : problème de ratio Tests sur quelques tubes pour voir quel ratio est optimal : 80/120 Deuxième série de tests : ça marche ! Tests sur la salive artificiellement augmentée en concentration : ça marche! Prochains tests à faire : - test sur des patients avant et après traitement. - protéines qui influent (ajout BSA) - Tester si les réactifs réagissent avec la créatine EXPLIQUER LES RESULTATS, EXTRAIRE LA CINETIQUE

17 Discussion Projet de l'an dernier : reposait sur 3 réactions enzymatiques, partant de la créatinine en passant par la créatine donnant de l'eau oxygénée. Le dosage de H2O2 permettait de remonter à la concentration de la créatinine mais problème de conservation des enzymes. En effet, pas de tampon où les 3 enzymes sont stables. Notre projet : plus simple, utilisation d'un seul réactif directement sur la créatinine, pas d'interférents gênants, pas d'inhibition de la réaction par la salive (valeurs DO de même ordre de grandeur quand créatinine dans de l'eau ou dans de la salive). Cependant, il reste à savoir d'où vient cette couleur orangé afin d'avoir toutes les clefs en main. Cela permettrait de connaitre l'enjeu chimique posé par ce complexe orange et ainsi d'éviter de passer à côté d'une donnée potentiellement importante. Ce quil reste à faire… : - développer une interface pour rendre cette méthode utilisable à tous !

18 Projet dinstrumentation – Cahier des charges Mini spectrophotomètre à une longueur donde (495 nm) Système électronique qui fait les calculs et donne le résultat Etudier le problème de létalonnage (courbe personnelle) Programme « normal » : On met léchantillon dans le puit, et le programme donne la concentration ! (Calculée à partir de la courbe détalonnage et de la pente trouvée). Comment mettre le réactif ? Etant donné que cest dangereux, ce nest pas le patient qui doit le faire => trouver un système dinstrumentation précis et fiable sous forme de distributeur automatique par exemple. Le patient doit mettre la bonne dose de salive. Attention : la quantité de salive à demander doit rester raisonnable (ici 80µL suffisait). Lhôpital fait une courbe à partir déchantillons Critère arbitraire, fixé à partir de moyennes

19 Projet dinstrumentation – Cahier des charges Autre solution : on voit qu'à t fixé, la DO n'est pas la même suivant la concentration de créatinine.

20 Projet dinstrumentation – Cahier des charges Donc variation de DO => changement de couleur Dans notre cas, visible à l'oeil nu donc visible par une caméra => un logiciel dans un téléphone portable avec caméra ou appareil photo permettant de donner la concentration de créatinine suivant le changement de couleur perçu par l'appareil et tenant compte de la vitesse à laquelle ce changement a eu lieu. Mais attention : faire les mesures dans le même environnement, dans les mêmes conditions. Et le prix sera nettement supérieur à celui d'un spectrophotomètre (1825 euros pour une gamme spectral large 360 à 900 nm).

21 Merci pour votre attention et place aux questions !

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