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Immunoprécipitation Travaux Pratiques Partie I. 1.1 Préparation de la solution d'Anticorps étudiée La solution mère AB contient 7,5 mg IgG/mL (Volume.

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1 Immunoprécipitation Travaux Pratiques Partie I

2 1.1 Préparation de la solution d'Anticorps étudiée La solution mère AB contient 7,5 mg IgG/mL (Volume total: 1mL) Prélever 100 µL de solution d'anticorps mère contenue dans le tube jaune (AB) et le mettre dans le tube rouge (AB étudiée). Prélever ensuite 900µL de la solution de NaCl et l'introduire dans le tube rouge (AB étudiée). Mélanger la solution AB étudiée en aspirant et réfoulant la solution plusieurs fois. Arrétez-vous à la première butée de la pipette, Autrement des bulles d'air pourraient se former! 1. Préparation de l'expérience

3 1.2 Dilution de la solution d'antigène étudiée Prélever 40µL provenant du tube violet (AG) et le mettre dans le tube bleu. Prélever ensuite 960µL de solution de NaCl et le mettre dans le tube bleu (AG étudiée). Mélanger la solution d'AG étudiée en aspirant et refoulant, la solution plusieurs fois. 1. Préparation de l'expérience

4 2.1 Mettre dans chaque cupule ( 1 à 7 ) 100µL de solution de NaCl. 2.2 Prélever 200µL de solution d'AG étudiée contenue dans le tube bleu et l'introduire dans la cupule µL AG 2. Préparation de la série de dilutions

5 2.3 Prélever 100µL de la solution d'AG de la cupule 8 et la mettre dans la cupule Mélanger le contenu de la cupule 7 en aspirant et refoulant la solution plusieurs fois. Arréter-vous à la première butée de la pipette autrement des bulles d'air pourraient se former µL AG 2. Préparation de la série de dilutions

6 2.5 Prélever 100µL provenant de la cupule 7 et la mettre dans la cupule Mélanger le contenu de la cupule 6 en aspirant et refoulant plusieurs fois. Procéder de la même façon jusqu'à la cupule Enlever 100µL de la cupule µL Enlever 100µL 2. Préparation de la série de dilutions

7 2.8 Mettre dans chaque cupule 100µL dAB étudiée provenant du tube rouge. 2.9 Incuber 5 minutes à température ambiante. 2. Préparation de la série de dilutions Quelle est maintenant la concentration d'antigène dans chaque cupule ?

8 Analyse des Anticorps Travaux Pratiques Partie II

9 Préparer les tubes selon le mode opératoire suivant. 1. Préparation des tubes pour la PAGE

10 1.1 Prélever 25µL de tampon Lämmli dans le tube vert (LÄ) à verser dans chaque tube (1 à 9). 1.2 Introduire 15µL d'H 2 O dans les tubes 1, 2, 4, 5, 7 et 8, puis 5µL d'H 2 O dans les tubes 3, 6 et Mélanger le contenu de la cupule 4 en aspirant et refoulant plusieurs fois. Introduire 10µL de précipité de la cupule 4 dans les tubes 1, 2 et Prélever 10µL de solution d'anticorps du tube rouge (AB étudiée) à mettre dans les tubes 4, 5 et Préparation des échantillons pour la PAGE

11 1.4 Prélever 10µL du tube bleu (AG) à mettre dans les tubes 7, 8 et Prélever 10µL de Dithiotreitol du tube jaune (DTT) à mettre dans les tubes 3, 6 et Préparation des tubes pour la PAGE

12 1.6 Mettre les tubes 2, 3, 5, 6, 8 et 9 pendant 5 minutes à 95° C sur plaque chauffante. 1. Préparation des tubes pour la PAGE

13 2. Préparation des cassettes de gel 2.1Couper l'emballage du gel PAGE en coupant le long de la ligne noire et prendre la cassette.

14 2.2 Couper avec un scalpel la bande de la cassette le long le la ligne marquée et enlever la bande du bas. 2. Préparation de l'expérience

15 3.1 Mettre la plaque de gel avec la plus petite plaque de verre vers lintérieur dans le support délectrode. 3.2 Placer le compartiment intérieur dans la structure dattache et fermer les attaches. 3.3Mettre la structure dattache avec le compartiment intérieur dans la cuve de tampon. 3. Préparation de la cuve délectrophorèse

16 4.1Remplir lélectrode verticale avec le tampon TGS jusquau bord. 4.2Remplir la cuve tampon avec 800mL de tampon TGS. 4.3Retirer le peigne. 4. Remplissage de la chambre avec du tampon.

17 Remplir les puits de gel : - 20 µL à partir du tube (1) - 20 µL à partir du tube (2) - 20 µL à partir du tube (3) - 5 µL de marqueurs protéique Kaleidoscope(KS) - 20 µL à partir du tube (4) - 20 µL à partir du tube (5) - 20 µL à partir du tube (6) - 20 µL à partir du tube (7) - 20 µL à partir du tube (8) - 20 µL à partir du tube (9) ABAGAB/AGKS 5. Remplissage des puits de gel

18 6.1Fermer la cuve et commencer lélectrophorèse à 150 V. 6.2Arrêter lélectrophorèse quand le colorant atteint lextrémité la plus basse du gel. 6. Exécution de lélectrophorèse

19 7.1Retirer la structure dattache et remettre le tampon dans le récipient du tampon. (Le tampon est à nouveau réutilisable!). 7.2Retirer les plaques de gel. 7. Démoulage du gel

20 8.1Ouvrir les plaques de verre et mettre le gel dans le bac à coloration. 8.2 Avant la coloration du gel le plonger dans l 'eau pendant 2 minutes puis le retirer. 8.3 Le colorer en ajoutant 100 mL de Bleu de Coomassie pendant 30 minutes au maximum. 8.4 Remettre le Bleu de Coomassie dans la bouteille de stockage et ajouter 100 mL d'eau tiède. 8.5 Mettre le gel dans l'agitateur. 8. Coloration des protéine

21 Tableau: Masses moléculaires des marqueurs protéiques Kaléidoscope 9.1 Tracer la droite d'étalonnage à l'aide des marqueurs protéiques Kaléidoscope. ProteinColorM MyosineBleu Da ß-galactosidaseMagenta Da Albumine bovine Vert Da Anhydrase carboniqueViolet Da Inhibiteur trypsique de graine de soja Orange Da LysozymeRouge Da AprotininBleu 7081 Da 9. Analyse

22 9.2 Déterminer la masse moléculaire des bandes de chaque ligne. Quelle bande appartient à quelle protéine? 9. Analyse


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