Travaux Pratiques ELISA

Présentation au sujet: "Travaux Pratiques ELISA"— Transcription de la présentation:

1 Travaux Pratiques ELISA
Expérience pour rechercher une infection au VIH Démonstration de la présence d’anticorps anti-VIH dans le sang

2 Préparations par l’enseignant

3 1. Préparation des solutions tampons
Tampon PBS (100 ml) 90 ml H2Odist ml PBS (10x) Le tampon PBS est nécessaire à la solubilisation des antigènes et des anticorps hydrophiles. Tampon de lavage (900 ml) 805 ml H2Odist ml PBS (10x) + 4,5 ml Tween 20 Le tampon de lavage est nécessaire pour diluer la solution d'anticorps et pour laver les plaques de microtitrage. Le Tween 20 contient de la SAB pour bloquer la surface plastique libre.

4 ! 2. Réhydratation Ouvrir les flacons d‘antigène et d‘anticorps
Ajouter 0,5 mL de tampon PBS dans le flacon d‘antigène et dans les flacons des anticorps primaire et secondaire Fermer les flacons et agiter pendant environ 2 minutes (solutions mères) Toutes ces solutions mères sont concentrées 50 fois ! Elles seront diluées juste avant la manipulation

5 3. Etiquetage Etiqueter trois flacons en polyéthylene avec: antigène
anticorps primaire anticorps secondaire Ils accueilleront les solutions diluées juste avant la manipulation

6 Préparations par les élèves 8 équipes

7 Vue d‘ensemble des tubes
Couleur du tube Etiquette Contenu Quantité vert “AG“ antigène 800 µl orange “sAB“ Anticorps secondaire marron “SUB“ substrat violet “pAB“ Anticorps primaire 120 µl bleu “WB“ Tampon de lavage jaune - - Encore vide!

8 1. Preparation des échantillons P1 – P8
- Légender les 8 tubes jaunes avec le numéro de votre groupe - Introduire 60 µL d’anticorps primaire (pAB, résultat positif du test) ou 60 µL de tampon de lavage (WB, résultat négatif du test) dans chacun des 8 tubes jaunes! Notez votre démarche (P1 – P8 sont les échantillons de sérum) - Distribuer 1 tube à chacune des 8 équipes !

9 Vue d‘ensemble complète des tubes
Couleur du tube Etiquette Contenu Quantité vert “AG“ antigène 800 µl orange “sAB“ Anticorps secondaire marron “SUB“ substrat violet “pAB“ Anticorps primaire 120 µl bleu “WB“ Tampon de lavage jaune “P1 – P8” Sérum sanguin, éch. 1 à 8 60 µl chacun 9

10 2. Réalisation du test

11 2.1 Fixation de l’antigène sur la microplaque de titration
- Légender la microplaque selon l’image ci-dessous P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 - Introduire 50 µl de solution d’antigène (AG, tube vert) dans chacun des 12 puits - Incuber pendant 5 minutes

12 Détection des anticorps Principes de base
Les antigènes se fixent à la phase solide

13 2.2 Lavage des microplaques de titration
Tapotez les microplaques sur un papier absorbant Introduire 250 µl de tampon de lavage dans chaque puits Attention! Pendant le pipetage, ne pas renverser de solution de lavage dans les autres puits! Tapotez les microplaques sur un papier absorbant

14 Détection des anticorps Principes de base
Les antigènes se fixent à la phase solide La surface plastique encore libre est bloquée

15 2.3 Préparation des contrôles et des échantillons
pAb contrôle positif: introduire 50 µL d’anticorps primaire (pAB, tube violet) dans les 2 puits étiquetés “ + ” contrôle négatif: introduire 50 µL de tampon de lavage (WB, tube bleu) dans les 2 puits étiquetés “ - ” WB P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8

16 2.3 Préparation des contrôles et des échantillons
échantillons 1 – 8: introduire 50 µL “d’échantillons de sérums à tester” P1 – P8 (tubes jaunes) dans les 8 puits etiquetés correspondant Utiliser un nouveau cône de pipette pour chaque puit ! P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 Incuber 5 minutes

17 Détection des anticorps Principes de base
Les antigènes se fixent à la phase solide La surface plastique encore libre est bloquée Les anticorps primaires éventuellement présents se fixent sur les antigènes

18 2.4 Lavage des microplaques (voir 2.2 )
vider + 250 µl WB vider

19 2.5 Ajout des anticorps secondaires
Introduire 50 µL d’anticorps secondaire (sAB, tube orange) dans chacun des 12 puits Incuber 5 minutes

20 Détection des anticorps Principes de base
Les antigènes se fixent à la phase solide La surface plastique encore libre est bloquée Les anticorps primaires éventuellement présents se fixent sur les antigènes Les anticorps secondaires (portant l‘enzyme) se fixent aux anticorps primaires éventuellement présents

21 2.6 Lavage des microplaques
deux fois (voir 2.2 ) vider + 250 µl WB vider 21

22 2.7 Ajout du substrat Incuber 5 minutes
Introduire 50 µL de substrat (SUB, tube marron) dans chacun des 12 puits Incuber 5 minutes

23 Détection des anticorps Principes de base
Les antigènes se fixent à la phase solide La surface plastique encore libre est bloquée Les anticorps primaires éventuellement présents se fixent sur les antigènes Les anticorps secondaires (portant l‘enzyme) se fixent aux anticorps primaires éventuellement présents La preuve de l‘infection est faite par la coloration du puit

24 3. Résultats Les échantillons positifs sont colorés en bleu, les échantillons négatifs restent incolores (Valider les contrôles). Vérifiez vos résultats (P1 – P8) dans l’équipe! exemple: P P2 P3 P P5 P6 P7 P8