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Travaux Pratiques ELISA Expérience pour rechercher une infection au VIH Démonstration de la présence danticorps anti-VIH dans le sang.

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1 Travaux Pratiques ELISA Expérience pour rechercher une infection au VIH Démonstration de la présence danticorps anti-VIH dans le sang

2 Préparations par lenseignant

3 Tampon de lavage (900 ml) 805 ml H 2 O dist ml PBS (10x) + 4,5 ml Tween 20 Le tampon de lavage est nécessaire pour diluer la solution d'anticorps et pour laver les plaques de microtitrage. Le Tween 20 contient de la SAB pour bloquer la surface plastique libre. 1. Préparation des solutions tampons Tampon PBS (100 ml) 90 ml H 2 O dist ml PBS (10x) Le tampon PBS est nécessaire à la solubilisation des antigènes et des anticorps hydrophiles.

4 2. Réhydratation Ajouter 0,5 mL de tampon PBS dans le flacon dantigène et dans les flacons des anticorps primaire et secondaire Toutes ces solutions mères sont concentrées 50 fois ! Elles seront diluées juste avant la manipulation Ouvrir les flacons dantigène et danticorps Fermer les flacons et agiter pendant environ 2 minutes (solutions mères) !

5 3. Etiquetage Etiqueter trois flacons en polyéthylene avec: - antigène - anticorps primaire - anticorps secondaire Ils accueilleront les solutions diluées juste avant la manipulation Antigène

6 Préparations par les élèves 8 équipes

7 Vue densemble des tubes Couleur du tube EtiquetteContenuQuantité vertAGantigène800 µl orangesABAnticorps secondaire800 µl marronSUBsubstrat800 µl violetpABAnticorps primaire120 µl bleuWBTampon de lavage120 µl jaune - Encore vide!

8 1. Preparation des échantillons P1 – P8 -Légender les 8 tubes jaunes avec le numéro de votre groupe -Introduire 60 µL danticorps primaire (pAB, résultat positif du test) ou 60 µL de tampon de lavage (WB, résultat négatif du test) dans chacun des 8 tubes jaunes! Notez votre démarche (P1 – P8 sont les échantillons de sérum) -Distribuer 1 tube à chacune des 8 équipes !

9 Vue densemble complète des tubes Couleur du tube EtiquetteContenuQuantité vertAGantigène800 µl orangesABAnticorps secondaire800 µl marronSUBsubstrat800 µl violetpABAnticorps primaire120 µl bleuWBTampon de lavage120 µl jaune P1 – P8 Sérum sanguin, éch. 1 à 860 µl chacun

10 2. Réalisation du test

11 2.1 Fixation de lantigène sur la microplaque de titration - Légender la microplaque selon limage ci-dessous -Introduire 50 µl de solution dantigène (AG, tube vert) dans chacun des 12 puits -Incuber pendant 5 minutes P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8

12 Détection des anticorps Principes de base Les antigènes se fixent à la phase solide

13 2.2 Lavage des microplaques de titration Tapotez les microplaques sur un papier absorbant Introduire 250 µl de tampon de lavage dans chaque puits Attention! Pendant le pipetage, ne pas renverser de solution de lavage dans les autres puits! Tapotez les microplaques sur un papier absorbant

14 Les antigènes se fixent à la phase solide La surface plastique encore libre est bloquée Détection des anticorps Principes de base

15 contrôle positif: introduire 50 µL danticorps primaire (pAB, tube violet) dans les 2 puits étiquetés Préparation des contrôles et des échantillons contrôle négatif: introduire 50 µL de tampon de lavage (WB, tube bleu) dans les 2 puits étiquetés - pAb WB P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8

16 Incuber 5 minutes échantillons 1 – 8: introduire 50 µL déchantillons de sérums à tester P1 – P8 (tubes jaunes) dans les 8 puits etiquetés correspondant Utiliser un nouveau cône de pipette pour chaque puit ! P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 2.3 Préparation des contrôles et des échantillons

17 Les anticorps primaires éventuellement présents se fixent sur les antigènes Les antigènes se fixent à la phase solide La surface plastique encore libre est bloquée Détection des anticorps Principes de base

18 2.4 Lavage des microplaques (voir 2.2 ) vider+ 250 µl WBvider

19 2.5 Ajout des anticorps secondaires Incuber 5 minutes Introduire 50 µL danticorps secondaire (sAB, tube orange) dans chacun des 12 puits

20 Les anticorps secondaires (portant lenzyme) se fixent aux anticorps primaires éventuellement présents Détection des anticorps Principes de base Les anticorps primaires éventuellement présents se fixent sur les antigènes Les antigènes se fixent à la phase solide La surface plastique encore libre est bloquée

21 2.6 Lavage des microplaques deux fois (voir 2.2 ) vider+ 250 µl WBvider

22 2.7 Ajout du substrat Incuber 5 minutes Introduire 50 µL de substrat (SUB, tube marron) dans chacun des 12 puits

23 La preuve de linfection est faite par la coloration du puit Les anticorps secondaires (portant lenzyme) se fixent aux anticorps primaires éventuellement présents Détection des anticorps Principes de base Les anticorps primaires éventuellement présents se fixent sur les antigènes Les antigènes se fixent à la phase solide La surface plastique encore libre est bloquée

24 3. Résultats Les échantillons positifs sont colorés en bleu, les échantillons négatifs restent incolores (Valider les contrôles). Vérifiez vos résultats (P1 – P8) dans léquipe! P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 exemple:


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