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22/02/20141Projet ATPase Danini Paul - Fouan Damien - Perret Thomas - Renaudot Raphael.

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1 22/02/20141Projet ATPase Danini Paul - Fouan Damien - Perret Thomas - Renaudot Raphael

2 22/02/2014 Projet ATPase Danini Paul - Fouan Damien - Perret Thomas - Renaudot Raphael2 Introduction Thèse de Thomas Ballet Thèse de Thomas Ballet Connaître la quantité de protéine renaturée Connaître la quantité de protéine renaturée Démarche: Démarche: Procéder par étape Procéder par étape Courbe standard de chaque réaction Courbe standard de chaque réaction

3 22/02/2014 Projet ATPase Danini Paul - Fouan Damien - Perret Thomas - Renaudot Raphael3 Réactions Enzyme + substrat+ enzyme + produit

4 22/02/2014 Projet ATPase Danini Paul - Fouan Damien - Perret Thomas - Renaudot Raphael4 Principe de la fluorescence Valeur de λ Résorufine Valeur de λ Résorufine λ max absorption = 530 nm λ max émission = 585 nm Choix des filtres λ absorption = 540 nm λ émission = 600 nm

5 22/02/2014 Projet ATPase Danini Paul - Fouan Damien - Perret Thomas - Renaudot Raphael5 La solution tampon : élément clé TRIS : 50 mM TRIS : 50 mM MgCl2 : 20 mM MgCl2 : 20 mM KCl : 150 mM KCl : 150 mM A pH = 7.2 A pH = 7.2

6 22/02/2014 Projet ATPase Danini Paul - Fouan Damien - Perret Thomas - Renaudot Raphael6 Première étape : gamme étalon de H2O2 AmplexRed + H 2 O 2 Resorufine HRP

7 22/02/2014 Projet ATPase Danini Paul - Fouan Damien - Perret Thomas - Renaudot Raphael7 Première étape : gamme de H 2 O 2

8 22/02/2014 Projet ATPase Danini Paul - Fouan Damien - Perret Thomas - Renaudot Raphael8 Première étape : gamme de H2O2 Puits1234 H202 (2 µM) AR (50 µM)10 HRP (0,3 U/ml)20 Tris

9 22/02/2014 Projet ATPase Danini Paul - Fouan Damien - Perret Thomas - Renaudot Raphael9 Première étape : gamme étalon de H2O2

10 22/02/2014 Projet ATPase Danini Paul - Fouan Damien - Perret Thomas - Renaudot Raphael10 Influence du DTT

11 22/02/2014 Projet ATPase Danini Paul - Fouan Damien - Perret Thomas - Renaudot Raphael11 Deuxième étape : gamme dADP globale Enzyme + substrat+ enzyme + produit

12 22/02/2014 Projet ATPase Danini Paul - Fouan Damien - Perret Thomas - Renaudot Raphael12 Deuxième étape : essai de la réaction globale

13 22/02/2014 Projet ATPase Danini Paul - Fouan Damien - Perret Thomas - Renaudot Raphael13 Troisième étape : gamme de pyruvate oxydase Enzyme + substrat+ enzyme + produit

14 22/02/2014 Projet ATPase Danini Paul - Fouan Damien - Perret Thomas - Renaudot Raphael14 Troisième étape : gamme de pyruvate oxydase A B12345 Pox (µL) [à 15 U/mL] Pyruvate (µL) [à 50 µM]10 FAD (µL) [à 25 µM]30 TPP (µL) [à 250 µM]30 Phosphate (µL) [à 10 mM]22222 HRP (µL) [à 0.1 U/mL]20 AR (µL) [à 50 µM]10 Tris (µL)

15 22/02/2014 Projet ATPase Danini Paul - Fouan Damien - Perret Thomas - Renaudot Raphael15 Troisième étape : gamme de pyruvate oxydase

16 22/02/2014 Projet ATPase Danini Paul - Fouan Damien - Perret Thomas - Renaudot Raphael16 Quatrième étape : gamme dADP globale Enzyme + substrat+ enzyme + produit

17 22/02/2014 Projet ATPase Danini Paul - Fouan Damien - Perret Thomas - Renaudot Raphael17 Quatrième étape : gamme dADP F G123456Blanc ADP (µL) 10 [à 10 µM] 50 [à 10 µM] 80 [à 10 µM] 10 [à 100 µM] 50 [à 100 µM] 80 [à 100 µM]0 FAD (µL) [à 250 µM] TPP (µL) [à 2.5 µM] PPP (µL) [à 250 µM] HRP (µL) [à 0.1 U/mL]20 kinase (µL) [à 50 U/mL]45 oxidase (µL)[à 15 U/mL]30 AR (µL) [à 50 µM]10 Phosphate (µL) [à 10 mM] Tris (µL)

18 22/02/2014 Projet ATPase Danini Paul - Fouan Damien - Perret Thomas - Renaudot Raphael18 Quatrième étape : gamme dADP

19 22/02/2014 Projet ATPase Danini Paul - Fouan Damien - Perret Thomas - Renaudot Raphael19 Dernière étape : gamme de pyruvate kinase Enzyme + substrat+ enzyme + produit

20 22/02/2014 Projet ATPase Danini Paul - Fouan Damien - Perret Thomas - Renaudot Raphael20 Dernière étape : gamme de pyruvate kinase A B12Blanc P Kinase (µL) [à 238 U/mL]9900 ADP (µL) [à 100 µM]10 PPP (µL) [à 250 µM]20 Pox (µL) [à 15 U/mL]30 Pyruvate (µL) [à 50 µM]10 FAD (µL) [à 250 µM]333 TPP (µL) [à 2.50 mM]333 Phosphate (µL) [à 10 mM]222 HRP (µL) [à 0.1 U/mL]20 AR (µL) [à 50 µM]10 Tris (µL)83292

21 22/02/2014 Projet ATPase Danini Paul - Fouan Damien - Perret Thomas - Renaudot Raphael21 Dernière étape : gamme de pyruvate kinase

22 22/02/2014 Projet ATPase Danini Paul - Fouan Damien - Perret Thomas - Renaudot Raphael22 Conclusion Résultats prometteurs Résultats prometteurs Utilisation du procédé: Utilisation du procédé: Cinétique possible Cinétique possible Mesure finale (?) Mesure finale (?) Solutions envisagées Solutions envisagées Kinase plus concentrée Kinase plus concentrée Merci de votre attention


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