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Microscopie confocale à balayage laser Romain Morichon IFR 65 Site St Antoine.

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1 Microscopie confocale à balayage laser Romain Morichon IFR 65 Site St Antoine

2 Principe microscope confocal Marvin Minsky Informaticien et roboticien américain Créateur de lintelligence artificielle et le père du confocal (1957)

3 Structure des plateformes Plateformes d'imagerie cellulaire Font partie de l'IFR 65 Regroupement 15 équipes INSERM, 10 équipes d'accueil P6. -Plateforme Tenon - 1 SP1 Leica (1998), 200K -1 SP2 Leica (2004) + Multiphoton (2006), 450K -Plateforme St Antoine -1 SP2 Leica (2012) -1 Spinning disk (2008) 350K

4 GFP

5 Principe microscope confocal

6 Au niveau de léchantillon

7 Exemple Cellule Hela Epifluorescence Confocal Microtubule F-Actine Noyaux

8 Résolution Microscopie conventionnelle d xy = 0,61. /ON d xz = 2. /ON 2 Microscopie Confocale d xy = 0,4. /ON d xz = 1,4. /ON 2 Gain : 15% en latérale 30% en axiale Exemple : 100X 1,4ON à 488nm Conventionnelle: dxy= 210nm dxz= 500nm Confocale dxy= 140nm dxz= 350nm

9 Quelques exemples de confocal Nikon A1+ Zeiss LSM 710 Olympus FLUOVIEW 1000 Leica SP5

10 LASER AOTF

11 LASER comme source de lumière Source lumineuse monochromatique intense Différents types de LASER: – Ar 457nm, 488nm, 514nm – ArKr 488nm, 568nm, 647nm – HeNe 543nm – HeNe 633nm – Diodes 405nm ou 488nm ou 561nm…

12 Choix des Fluorochromes Alexa nm 543nm 561nm Choisir les fluorochromes en fonction des lasers disponibles. Plus lexcitation sera loin du maximum dabsorption plus lémission sera faible.

13 AOTF Linteraction entre la lumière et une onde acoustique produit une diffraction de la lumière. A partir dune fréquence acoustique donnée on sélectionne une longueur donde. Possibilité de sélectionner jusquà 8 raies et den moduler leurs intensités Laser 1 Laser 2 Laser 3 Laser 4 Laser 5

14 Leica SP5 AOBS

15 AOBS vs Dichroique Permet de supprimer les filtres dichroïques classiques qui ont des caractéristiques fixes et une bande passante faible. possède une grande flexibilité et une meilleure efficacité permet de réduire la puissance de laser tout en réalisant des acquisitions plus rapides permet de contrôler jusqu'à 8 raies lasers de façon séquentielle ou simultanée. Courbe de transmission

16 Leica SP5 Système de balayage XY Système de balayage Z

17 Balayage XY 1 2 Effectué par 2 miroirs orientés par des moteurs galvanométriques ou résonnants Balayage x en continu Balayage y incrémenté Vitesse de balayage 200, 400, 800 ou 1000 Hz pour un galvanomètre linéaire et jusquà 8000Hz pour un résonnant. GSI Lumonics OSS Uni Bi

18 Vitesse de balayage

19 Balayage Z En bougeant lobjectif – Z drive: grande amplitude, précision 10nm – Objectif piezo: faible amplitude (400µm), grande précision (n) En bougeant la platine – Piezo: faible amplitude (500µm), grande précision (nm) – Galvo: grande amplitude (1,5mm), grande précision (10nm)

20 Leica SP5 Pinhole

21 ConfocalNon confocal

22 ouverture du pinhole d < 0.7AU Diamètre douverture faible -> Section optique fine =résolution Z élevée =Signal récupéré faible d > 1AU Diamètre douverture élevé -> Section optique épaisse =résolution Z faible =Signal récupéré élevé Pinhole optimisé pour chaque objectif à 1AU

23 Leica SP5 Système de détection

24 Prisme/fente spectrale PMT

25 Rendement 40% Photodiode Rendement 80%

26 Gain et offset Gain: Amplifie le signal dentré -> luminosité de limage augmentée Offset: Permet denlever le bruit fond de limage Effet de saturation Épaisseur=0,85µm Épaisseur=1,35µm Lut « glow over/under »

27 Image Chaque pixel (picture element) a une coordonnée et une valeur dintensité. Format de limage 512x512, 1024x1024, 2048x2048… Pour du qualitatif -> Intensité codée sur 8 bits (256 niveaux de gris) Pour du quantitatif -> Intensité codée sur 12 bits (4096 niveaux de gris) Lœil ne perçoit que 30 à 40 niveaux de gris

28 Résolution La capacité dun système optique à distinguer deux points distincts. Combien de pixel ais je besoins pour reproduire lobjet avec la meilleur résolution? -> Critère de Nyquist Pas déchantionnage = r/2,3 Objectifs Longueur donde (nm) ON Rxy (nm) Taille du pixel (nm) Zoom 512x x x X5001, X2X1X Exemple: 1024X X256

29 Moyennage Sans 2X8X Fait la moyenne arithmétique de chaque valeur dintensité de chaque pixel Amélioration du rapport signal/bruit Moyennage par ligne utilisé pour expérimentation sur le vivant

30 Accumulation Les valeurs dintensités mesurées sont additionnées pour chaque point de balayage => Permet daugmenter le signal en cas de marquage faible Sans 2X4X

31 Zoom Zoom 1 Zoom 2 Zoom 4 Une zone plus petite est scannée avec le même nombre de pixels -> la résolution reste constante, Les détails sont augmentés

32 Multimarquage Attention au chevauchement de spectres Acquisition simultanée a = Anti RF(Alexa 488) b = C12 Bodipi 568 c = Merge Acquisition séquentielle 488 puis 568 d = Anti RF(Alexa 488) e = C12 Bodipi 568 f = Merge Acquisition séquentielle si utilisation de 2 fluorochromes proches! a bc def PMT 2

33 Acquisition sections optiques Acquisition de 80 images à 200nm dintervalle en 1024x1024 Projection Cellule MDCK Vert Alexa 488 marquage de la protéine MDR3 Rouge Iodure de propidium marquage nucléaire

34 Reconstruction 3D

35 Coupe XZ Coupe XY Coupe XZ Cellule MDCK Vert Alexa 488 marquage de la protéine MDR3 Rouge Iodure de propidium marquage nucléaire Accumulation apicale de MDR3

36 Co-localisation A anti-FLAG M2 Alexa Fluor 546 B anti CD-3 / Alexa Fluor 633 C Merge

37 Time Laps -Cellules MA104 -Sonde Calcium MC164 cagée -Sonde desestérifiée dans cellule, devient fluo quand fixée au Ca -Acquisition toutes les 10 secondes de 5 coupes

38 Applications

39 Microscope confocal biphoton Confinement de lexcitation laser -> pas de pinhole -> moins de photons perdus Grande profondeur dobservation (jusquà 300µm) Pas de photoblanchiement hors du plan focal GFP : 1 photon à 488nm 2 photons à 960 nm…

40 Préservation échantillon RésolutionRapiditéMulticouleurs Échantillon épais Microscope confocal Microscope Biphoton Spinning disk Apotome-+-++ Vidéo microscope

41 Merci à tous pour votre attention


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