Microscopie confocale à balayage laser

Présentation au sujet: "Microscopie confocale à balayage laser"— Transcription de la présentation:

1 Microscopie confocale à balayage laser
Romain Morichon IFR 65 Site St Antoine

2 Principe microscope confocal
Marvin Minsky Informaticien et roboticien américain Créateur de l’intelligence artificielle et le père du confocal (1957)

3 Structure des plateformes
Plateformes d'imagerie cellulaire Font partie de l'IFR 65 Regroupement 15 équipes INSERM, 10 équipes d'accueil P6. Plateforme Tenon 1 SP1 Leica (1998), 200K€ 1 SP2 Leica (2004) + Multiphoton (2006), 450K€ Plateforme St Antoine 1 SP2 Leica (2012) 1 Spinning disk (2008) 350K€

4 GFP

5 Principe microscope confocal

6 Au niveau de l’échantillon

7 Microtubule F-Actine Noyaux
Exemple Cellule Hela Epifluorescence Confocal Microtubule F-Actine Noyaux

8 Résolution Microscopie conventionnelle dxy = 0,61./ON dxz= 2./ON2
Microscopie Confocale dxy = 0,4./ON dxz= 1,4./ON2 Gain : 15% en latérale 30% en axiale Exemple : 100X 1,4ON à 488nm Conventionnelle: dxy= 210nm dxz= 500nm Confocale dxy= 140nm dxz= 350nm

9 Quelques exemples de confocal
Zeiss LSM 710 Nikon A1+ Leica SP5 Olympus FLUOVIEW 1000

10 Leica SP5 LASER AOTF

11 LASER comme source de lumière
Source lumineuse monochromatique intense Différents types de LASER: Ar 457nm, 488nm, 514nm ArKr 488nm, 568nm, 647nm HeNe 543nm HeNe 633nm Diodes 405nm ou 488nm ou 561nm…

12 Choix des Fluorochromes
514nm 561nm Alexa 568 Alexa 568 Choisir les fluorochromes en fonction des lasers disponibles. Plus l’excitation sera loin du maximum d’absorption plus l’émission sera faible. 543nm Alexa 568

13 AOTF L’interaction entre la lumière et une onde acoustique produit une diffraction de la lumière. A partir d’une fréquence acoustique donnée on sélectionne une longueur d’onde. Possibilité de sélectionner jusqu’à 8 raies et d’en moduler leurs intensités Laser 1 Laser 2 Laser 3 Laser 4 Laser 5

14 Leica SP5 AOBS

15 Courbe de transmission
AOBS vs Dichroique Permet de supprimer les filtres dichroïques classiques qui ont des caractéristiques fixes et une bande passante faible. possède une grande flexibilité et une meilleure efficacité permet de réduire la puissance de laser tout en réalisant des acquisitions plus rapides permet de contrôler jusqu'à 8 raies lasers de façon séquentielle ou simultanée. Courbe de transmission

16 Leica SP5 Système de balayage XY Système de balayage Z

17 Balayage XY Effectué par 2 miroirs orientés par des moteurs galvanométriques ou résonnants Balayage x en continu Balayage y incrémenté Vitesse de balayage 200, 400, 800 ou 1000 Hz pour un galvanomètre linéaire et jusqu’à 8000Hz pour un résonnant. GSI Lumonics OSS 2500 1 2 Uni 1 Bi 2

18 Vitesse de balayage

19 Balayage Z En bougeant l’objectif En bougeant la platine
Z drive: grande amplitude, précision 10nm Objectif piezo: faible amplitude (400µm), grande précision (n) En bougeant la platine Piezo: faible amplitude (500µm), grande précision (nm) Galvo: grande amplitude (1,5mm), grande précision (10nm)

20 Leica SP5 Pinhole

21 Pinhole Confocal Non confocal

22 Pinhole optimisé pour chaque objectif à 1AU
ouverture du pinhole d < 0.7AU Diamètre d’ouverture faible -> Section optique fine =résolution Z élevée =Signal récupéré faible d > 1AU Diamètre d’ouverture élevé -> Section optique épaisse =résolution Z faible =Signal récupéré élevé Pinhole optimisé pour chaque objectif à 1AU

23 Leica SP5 Système de détection

24 Prisme/fente spectrale
PMT PMT PMT PMT PMT

25 PMT PMT Rendement 40% Photodiode Rendement 80%

26 Gain et offset Gain: Amplifie le signal d’entré -> luminosité de l’image augmentée Offset: Permet d’enlever le bruit fond de l’image Lut « glow over/under » Effet de saturation Épaisseur=0,85µm Épaisseur=1,35µm

27 Image Chaque pixel (picture element) a une coordonnée et une valeur d’intensité. Format de l’image 512x512, 1024x1024, 2048x2048… Pour du qualitatif -> Intensité codée sur 8 bits (256 niveaux de gris) Pour du quantitatif -> Intensité codée sur 12 bits (4096 niveaux de gris) L’œil ne perçoit que 30 à 40 niveaux de gris

28 Résolution La capacité d’un système optique à distinguer deux points distincts. Combien de pixel ais je besoins pour reproduire l’objet avec la meilleur résolution? -> Critère de Nyquist Pas d’échantionnage = r/2,3 1024X1024 256X256 Exemple: Objectifs Longueur d’onde (nm) ON Rxy (nm) Taille du pixel (nm) Zoom 512x512 1024x1024 2048x2048 63X 500 1,4 160 70 4X 2X 1X

29 Moyennage 2X 8X Sans Fait la moyenne arithmétique de chaque valeur d’intensité de chaque pixel Amélioration du rapport signal/bruit Moyennage par ligne utilisé pour expérimentation sur le vivant

30 Accumulation Sans 2X 4X Les valeurs d’intensités mesurées sont additionnées pour chaque point de balayage => Permet d’augmenter le signal en cas de marquage faible

31 Zoom Une zone plus petite est scannée avec le même nombre de pixels -> la résolution reste constante, Les détails sont augmentés Zoom 1 Zoom 2 Zoom 4

32 Acquisition séquentielle si utilisation de 2 fluorochromes proches!
Multimarquage Attention au chevauchement de spectres Acquisition simultanée a = Anti RF(Alexa 488) b = C12 Bodipi 568 c = Merge a b c Acquisition séquentielle 488 puis 568 d = Anti RF(Alexa 488) e = C12 Bodipi 568 f = Merge d e f PMT 2 Acquisition séquentielle si utilisation de 2 fluorochromes proches!

33 Acquisition Acquisition de 80 images à 200nm d’intervalle en 1024x1024
sections optiques Acquisition de 80 images à 200nm d’intervalle en 1024x1024 Cellule MDCK Vert Alexa 488 marquage de la protéine MDR3 Rouge Iodure de propidium marquage nucléaire Projection

34 Reconstruction 3D

35 Coupe XZ Cellule MDCK Vert Alexa 488 marquage de la protéine MDR3
Rouge Iodure de propidium marquage nucléaire Coupe XY Accumulation apicale de MDR3 Coupe XZ

36 Co-localisation A anti-FLAG M2 Alexa Fluor 546
B anti CD-3 / Alexa Fluor 633 C Merge

37 Time Laps Cellules MA104 Sonde Calcium MC164 cagée
Sonde desestérifiée dans cellule, devient fluo quand fixée au Ca Acquisition toutes les 10 secondes de 5 coupes

38 Applications

39 Microscope confocal biphoton
GFP : 1 photon à 488nm 2 photons à 960 nm… Confinement de l’excitation laser -> pas de pinhole -> moins de photons perdus Grande profondeur d’observation (jusqu’à 300µm) Pas de photoblanchiement hors du plan focal

40 Préservation échantillon
Résolution Rapidité Multicouleurs Échantillon épais Microscope confocal - ++ + Microscope Biphoton Spinning disk Apotome Vidéo microscope

41 Merci à tous pour votre attention