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La fluorescence Application à la biologie. La fluorescence I.Principe de la fluorescence II.Microscopie à épifluorescence.

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1 La fluorescence Application à la biologie

2 La fluorescence I.Principe de la fluorescence II.Microscopie à épifluorescence

3 Généralités Les fluorophores sont avant tout des chromophores Les chromophores sont des constituants moléculaires qui absorbent la lumière hc/λ 1, Ce sont en général des composés aromatiques. Excités,les fluorophores peuvent, eux, émettre de la lumière à une longueur donde différente hc/λ 2 4n+2 e -

4 Quest-ce quune molécule fluorescente ? Photon (lumière d'excitation) Émission de fluorescence, de plus faible énergie (plus grande longueur donde) Perte dénergie La fluorescence est caractérisée par des transitions électroniques entre un état singulet fondamental et l'état singulet excité. La durée de vie moyenne de l'état excité est de l'ordre de à s GFP : τ = 2,1 ns e-e-

5 ENERGIE Diagramme de Jablonski (simplifié) S0S0 S1S1 T1T1 ABS FL Relax th Phosp Photoblanchiement E exc = E em + chaleur E exc = E em + chaleur (Eexc > Eem) E = (hc)/ λ exc < λ em

6 Les molécules fluorescentes utiles en biologie Des protéines De petites molécules aromatiques Des nanocristaux de semiconducteurs

7 GFP AbsorptionRendement Q

8 Représentation dune protéine fluorescente tétramérique (asFP595) Chromophore (GFP) : -S-Y-G- Maturation post-traductionnelle du fluorophore de la GFP

9 Les marquages en immunofluorescence Coupe semi-fine Antigène Anticorps secondaire Anticorps primaire Echantillon fluorochrome

10

11 Représentation dun fluorophore inorganique (Alexa 568)

12 Exemple de quadruple marquage Alexa nm TRITC Cy5 DAPI ex em UVIR

13 Photoblanchiment (photobleaching, fading) Photoblanchiment (photobleaching, fading) Fluorescence (% valeur initiale) Temps (secondes) Alexa 488 Oregon Green 514 BODIPY Oregon Green 488 Fluorescein

14 Spectre continu

15 Observation en lumière transmise Observation en fluorescence avec un jeu de filtre spécifique de la GFP Trajet optique Microscope droit Observation en fluorescence avec un jeu de filtre spécifique de lAlexa 568.

16 Exemple dimage en épifluorescence (dendrites de neurone P-GFP)

17 Cest tout et cest déjà pas mal !!!!

18 - immunofluorescence : FITC, TRITC, lissamine rhodamine, Texas Red, Cy3, Cy5, Alexa Fluors - ADN : iodure de propidium, YOYO, Syto16, chromomycine A3, mithramycine; DAPI, Hoechst, DRAQ5, TOTO3 - mitochondie : sensible au potentiel membranaire Rhodamine 123, DiOC 6 (3), DiOC 7 (3), JC-1, MitoTracker Red CMXRos (post- fixation possible) - membranes : FM1-43, FM4-64, fusions-GFP, divers anticorps de surface - Viabilité : FDA, exclusion diodure de propidium,… morphologie, avec DIC - réticulum endoplasmique: (non spécifique) DiOC 6 (5), GFP-taggée - appareil de Golgi : GFP-taggée, anticorps, NBD-C 6 -ceramide (pas pour végétaux) - dépendance envers le pH : carboxy-SNARF-1, BCECF - dépendance envers le calcium : Fluo-3 ou -4 (± FF), FuraRed, CalciGreen, Indo-1, Cameleon - divers : Acridine Orange, Neutral Red, Lucifer Yellow, chlorophylle, - Protéines Autofluorescentes Principaux fluorochromes utilisés en microscopie en épifluorescence et confocale Principaux fluorochromes utilisés en microscopie en épifluorescence et confocale

19 Quelques documents Wikipedia Live Cell Imaging (Goldman&Spector, Cell Press) Invitation à la fluorescence moléculaire (Valeur, De Boeck) Cell Imaging Techniques (Mossman, Brooke, Taatjes, Douglas, Humanan Press) Fluorescence microscopy (Rost, Fre, Cambridge University Press)

20 Bonus GFP photoactivable, photoconversion Quantum dots

21 Les paramètres caractéristiques dun fluorophore : Spectre dabsorption : capacité à absorber la lumière (chromophore) caractérisé par son maximum Spectre démission : capacité à émettre de la lumière après excitation caractérisé par son maximum Décalage de Stokes : mesure lécartement des deux spectres précédents, en général on préfère les fluorophores ayant un grand « Stokes shift » Coefficient d'extinction molaire ε : il mesure la quantité de lumière absorbée par mole de fluorophore (excitabilité) (λ donné) Rendement quantique Φ : probabilité quun fluorophore excité émette un photon (efficacité de fluorescence) 0<Φ<1 Brillance : proportionnelle à la quantité de lumière émise par fluorescence à une lumière dexcitation donnée. B = ε x Φ Cinétique de photoblanchiment : sensibilité du fluorophore Durée de vie à létat excité (pour certaines applications) e-e-

22 Photo-activation exemple : PA-GFP Ando, Ryoko et al. (2002) PNAS. 99,

23 Quantum dot: particule fluorescente non aromatique !!! nm Core nanocrystals with size between 3-8 nm (CdSe, CdTe, CdS, ZnSe) anorganic shell (ZnS, CdS) organic shell (silica/siloxane, phospholipides, proteins)

24 Ordre de grandeur - Q-dot

25 Propriétés Brillance = ε.Φ F eGFP Q Dot Forte brillance Résistance au photoblanchiement Clignotement Large gamme de spectre accessible en excitant dans le domaine UV

26 Exemple dapplication : suivi de molécules uniques 1 μm


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