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Université Dr Moulay Tahar-Saida Faculté des Sciences &Technologies Département de Biologie Travaux dirigés Electrophysiologie TRAVAUX PRATIQUES Organisation.

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1 Université Dr Moulay Tahar-Saida Faculté des Sciences &Technologies Département de Biologie Travaux dirigés Electrophysiologie TRAVAUX PRATIQUES Organisation du Système nerveux de Rat

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3 Le neurone et son potentiel membranaire de repos Extérieur de la membrane : Ions positifs = surtout Na+ (et un peu de K+) Ions négatifs = Cl- surtout Intérieur de la membrane : Ions positifs = surtout K+ (et un peu de Na+) Ions négatifs = portéines et ions phosphates Surplus dions positifs Surplus dions négatifs

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5 Milieu Extérieur [CATIONS]e = [ANIONS]e en mEq [Na]e + [K]e + 2 x [Ca]e = [Cl]e (2 x 1) = 147 Milieu Intérieur [CATIONS]i = [ANIONS]i en mEq [Na]i + [K]i + 2 x [Ca]i = [Cl]i + [P]i (2 x ) = 14 + [P]i [P]i = mEq

6 Le nombre de particules en solution situ é de chaque côt é de la membrane doit être le même, quelle que soit la charge de ces particules. C'est l' é quilibre osmotique. En effet, si la pression osmotique des deux milieux n'est pas é gale, il se produira des mouvements d'eau (du milieu le moins concentr é vers le milieu le plus concentr é ) qui modifieront le volume cellulaire.Dans ce cas, il s agit de concentration et non pas de charge et par cons é quent le Ca est = 1 mOsm ext et 10-4 mOsm int [IONS]e = [IONS]i en mOsm [Na]e + [K]e + [Ca]e + [Cl]e = [Na]i + [K]i + [Ca]i + [Cl]i + [P]i = ˉ [P]i [P]i = 125 mOsm Valence de P = / 125 = - 1,12 Sous l influence du gradient de concentration : [C+]1 > [C+]2, les cations, seuls diffusibles, vont passer du compartiment 1 vers le compartiment 2. Le travail fourni pour d é placer un ion le long de son gradient de concentration d é pend : R = joules / mol./ °K, temp é rature absolue T° Kelvin = T° Celsius des concentrations dans chaque compartiment [C+]1 & [C+]2 tel que : W [ ] = R. T. ln [C+]2 / [C+]1 : ( Le rapport C2/C1)

7 un gradient électrostatique de 2 vers 1 Le travail électrostatique Le transfert des cations de 1 vers 2 a « polarisé » la membrane [1 : (-) – 2 : (+)] et crée un gradient électrostatique de 2 vers 1, qui tend à sopposer à la fuite ionique né du gradient de concentration. Le travail électrostatique, sopposant à la diffusion de lion dépend : de la valence de lion Z, de la quantité délectricité que représente un ion gramme F = Faraday = coulombs, de la force électromotrice générée E, W : le travail électrostatique, tel que : W = Z. F. E Le flux ionique n é d un gradient de concentration est autolimit é par le champ é lectrique qu il engendre. Z. F. E. = R. T. ln [C+]2 / [C+]1 Eion (Volts) = R.T / Z. F. ln [C+]2 / [C+]1 É QUATION DE NERNST Soit une membrane neuronale de mammifère : T = 37°C = = 310 °K R. T / F = ( ) / = ln = 2.3 log10 1 Volt = millivolts (mV)

8 Potentiel d'équilibre des ions K+ E K = - 87 mV Potentiel d'équilibre des ions Na+ E Na = + 60 mV Potentiel d'équilibre des ions Ca2+ E Ca = mV Potentiel d'équilibre des ions Cl- E Cl = - 61 mV Eion (mV) = [(1 000 x x 2.3) / Z] log10 [ion]e / [ion]i = 60 / Z log10 [ion]e / [ion]i LE GRADIENT É LECTROCHIMIQUE : Vm – Eion potentiel d' é quilibre Pour traverser la membrane, un ion est soumis à un gradient é lectrochimique (ou " driving-force" des anglo-saxons), qui s'exprime par la diff é rence entre le potentiel de membrane (Vm) de la cellule et le potentiel d' é quilibre de l'ion consid é r é (Eion). Le flux net d'une esp è ce ionique au travers de ses propres canaux est proportionnel à ce gradient é lectrochimique

9 POTENTIEL D'EQUILIBREGRADIENT ELECTRO-CHIMIQUEFLUX NET EK = - 87 mVVm - EK = (-87) = + 27 mV SORTANT ENa = + 60 mVVm - ENa = (+60) = mV ENTRANT ECa = mVVm - ECa = (+120) = mV ENTRANT ECl = - 61 mVVm - ECl = (-61) = + 1 mV ÉQUILIBRE LA CONDUCTANCE IONIQUE MEMBRANAIRE la conductance é lectrique (exprim é e en Siemens, S) : la facilit é avec laquelle un courant se d é place entre deux points : c'est l'inverse de la r é sistance (exprim é e en ohms, W). Dans le cas d'un canal ionique, la conductance caract é rise la facilit é avec laquelle les ions traversent le pore aqueux de la prot é ine-canal. La conductance de toute la membrane d'une cellule pour un ion (conductance ionique membranaire), gion, est proportionnelle à la conductance é l é mentaire d'un canal ionique : μion, mais aussi au nombre total de canaux de l'esp è ce ionique consid é r é e dans la membrane : Nion et à la probabilit é p0 pour que ces canaux soient à l' é tat ouvert : gion = μion. Nion. p0

10 LES COURANTS IONIQUES L'intensit é du courant (Iion, exprim é en Amp è res : Coulombs.sec-1) traversant un canal ionique ou courant ionique é l é mentaire est é gale à : Courant ionique membranaire (Iion) = gion (Vm - Eion) : « I = g x V » LA MEMBRANE NEURONALE EST PERM É ABLE À PLUSIEURS IONS : D É TERMINATION DU POTENTIEL DE REPOS On pensait que la membrane neuronale é tait s é lectivement perm é able aux ions K+. Des é tudes plus r é centes ont pu montrer que la membrane neuronale au repos est perm é able, à la fois, aux ions K+ et Na+. Il appara î t simplement, qu'au repos, la conductance membranaire des ions K+ (gK) est plus grande que celle des ions Na+ (gNa). Supposons une cellule dont la membrane comporte, à la fois, des canaux K+ et Na+ ouverts. Nous savons que cette cellule dispose de m é canismes de transport actif (pompe Na+/K+/ATPase) qui permettent de maintenir les concentrations des ions K+ et Na+, de part et d'autre de la membrane, constantes

11 Le potentiel de membrane de la cellule (Vm) atteindra un é tat stable quand le flux net des charges (K+ & Na+) passant à travers la membrane sera nul, soit, quand INa + IK = 0. (Iion) = gion (Vm – Eion) -IK = gK (Vm - EK) ; INa = gNa (Vm - ENa) Quand : quand INa + IK = 0. gK (Vm - EK) + gNa (Vm - ENa) = 0 Vm = (gK. EK + gNa. ENa) / (gK + gNa) La valeur du potentiel de membrane d é pend de la conductance relative des deux ions: gNa / gK Supposons a = gNa/gK : Vm = (EK + a. ENa) / 1 + a exemple, o ù Vm = -60 mV, EK = -87 mV et ENa = + 60 mV, Vm = (EK + a. ENa) / 1 + a, on remplace par les valeurs de l exemple ci-dessus, on a donc a = 0.2, et que a = gNa/gK, a x g K = g Na ; ce qui signifie que la conductance des ions K+ est 5 fois plus grande que celle des ions Na+ soit : gK = 5. gNa. ( parceque a = 0.2) Les potentiels d' é quilibre des ions K+ (EK) et Na+ (ENa) restent donc constants. Le potentiel de membrane (Vm), qui va s' é tablir, est donc interm é diaire entre les potentiels d' é quilibre des deux ions, soit entre EK (-87 mV) et ENa (+ 60 mV).

12 Dans la majorit é des cellules au repos, il y a beaucoup plus de canaux K+ que de canaux Na+ ouverts. Mais, le courant sortant potassique n'est cependant pas 5 fois plus important que le courant entrant sodique car le gradient é lectrochimique potassique (Vm - EK = + 27 mV) est beaucoup moins important que le gradient é lectrochimique sodique (Vm - ENa = mV) voir tableau pr é c é dent En fait, 2 ions K+ sortent de la cellule quand 3 ions Na+ y entrent, parceque dans le tableau pr é c é dent on a pour le potentiel d é quilibre des deux ions -87 m V pour K+ et 60 m V pour Na+ donc on a a un rapport de 2 x (-87 ) = 3 x ( + 60 ) a l é quilibre. La cellule nerveuse aurait donc tendance à se vider de son K+ et à se remplir de Na+ si un syst è me de transport actif, et donc consommateur d' é nergie, ne venait r é tablir l' é quilibre en expulsant 3 ions Na+ contre l'entr é e de 2 ions K+.

13 Le neurone et le potentiel daction (PA) Lexcitation nerveuse est accompagnée dune onde électrique qui se propage le long du nerf Onde = influx nerveux ou potentiel daction

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15 Le neurone et le potentiel daction (PA) Un stimulus électrique en dessous du seuil est dit infraliminaire et ne provoque pas de PA. Un stimulus électrique au dessus du seuil est dit supraliminaire provoque un PA.

16 Le neurone et le potentiel daction (PA) Une stimulation augmente le potentiel de repos. Si le seuil de stimulation est dépassé (si la dépolarisation est suffisante), il y a apparition dun PA. Durant le PA, la polarité du potentiel de membrane (- 70 mV) sinverse brutalement et atteint une valeur pic de + 40 mV à + 50 mV. La production de PA est rendue possible par la présence de nombreux types de canaux ioniques dans la membrane plasmique des neurones. Ex: les canaux Voltage dépendant (sensibles au voltage) Ces canaux souvrent et se ferment en réponse à des stimuli particuliers laissant ainsi échapper des ions : ce qui va modifier le potentiel de membrane.

17 Le neurone et le potentiel daction (PA) Cas des neurones : Les canaux sodiques voltage dépendant - 70 mV+ 40 mV

18 Le neurone et le potentiel daction (PA). Les neurones peuvent réagir à un stimulus (excitabilité). La réaction = ouverture des canaux sodiques voltage dépendant. Intérieur de la cellule Extérieur de la cellule Canal à Na + ferméCanal à Na + ouvert Membrane cellulaire Baisse dions + à lextérieur Hausse dions + à lextérieur Na +

19 Le neurone et le potentiel daction (PA). A lendroit où sexerce le stimulus, on a une ouverture des canaux à sodium qui provoquent une entrée massive de Na+, ce qui entraîne un changement de polarité membranaire. La membrane est plus perméable au Na + quau K + pendant la dépolarisation, jusquau pic du PA. Au point stimulé, la polarité sinverse

20 Le neurone et le potentiel daction (PA). Le point dépolarisé reprend rapidement sa polarité car : fermeture des canaux à Na+ Ré-ouverture des canaux à K+ (augmentation de la perméabilité membranaire au K+) PA

21 Dépolarisation Entrée de Na + Période réfractaire absoluePériode réfractaire relative Potentiel de repos Seuil dexcitation Hyperpolarisation tardive Repolarisation Sortie de K + Potentiel daction Temps Le neurone et le potentiel daction (PA) (12) : les périodes réfractaires

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23 La phase ascendante du potentiel d'action est due à l'ouverture de canaux Na+ sensibles au voltage. Au repos, la probabilit é (p0) pour que ces canaux soient ouverts est tr è s faible et la plupart sont ferm é s. Pour une certaine valeur du potentiel de membrane (Vm = - 40 mV - valeur seuil), la d é polarisation membranaire provoque une ouverture rapide des canaux Na+- Vm d é pendants ( canaux sodique d é pendant du voltage Vm ) ce qui entra î ne une entr é e brutale de Na+ dans la cellule. Ce courant sodique entrant augmente la d é polarisation membranaire, qui elle-même provoque une nouvelle entr é e d'ions Na+ etc... Ce processus r é g é n é ratif induit la phase ascendante du PA. Mais, le pic du PA n'atteint pas exactement le potentiel d' é quilibre des ions Na+ (ENa = + 60 mV) car, tr è s vite, les processus mis en jeu lors de la phase descendante du PA entrent en jeu.

24 Deux facteurs limitent la dur é e du PA : (a) la d é polarisation finit par inactiver graduellement les canaux Na+ (les canaux se referment bien que la membrane reste d é polaris é e : ils s'inactivent) ce qui induit, avec un certain d é lai, (b) l'ouverture de canaux K+ Vm d é pendants (> + 20 mV : p0 d'ouverture maximale). Ce d é lai d'ouverture leur vaut le nom de canaux K+ de la "rectification retard é e". Dans la plupart des cellules nerveuses, le PA est suivi d'une phase d'hyperpolarisation transitoire ou post-hyperpolarisation. Cette hyperpolarisation appara î t car, contrairement aux canaux Na+, les canaux K+ ne s'inactivent pas et ce courant sortant potassique hyperpolarise l é g è rement la membrane. Le nombre de canaux K+ ouverts diminue progressivement et le potentiel de membrane revient à son niveau initial

25 Cette d é polarisation initiale est n é cessaire à l'ouverture des canaux Na+ Vm d é pendants, ouverture qui induit un processus r é g é n é ratif (phase ascendante du PA). Ces m é canismes expliquent que la survenue d'un PA r é ponde à la loi du tout ou rien. Les ions Na+ entrant dans le cytoplasme vont chasser les cations intracytoplasmiques les plus abondants (en l'occurrence les ions K+ : 2 charges de même signe se repoussent), qui vont conduire le courant à l'int é rieur de l'axone, entra î nant, à distance du point o ù est n é le PA, une d é polarisation membranaire locale. Si, à ce niveau, les canaux Na+ Vm d é pendants sont en concentration suffisante et que la d é polarisation locale est assez forte, il y aura é mission d'un autre PA ("conduction r é g é n é rative

26 Remarquons, que lorsque l'influx nerveux se propage, il ne peut revenir en arri è re du fait de l'inactivation des canaux Na+. Tout ceci explique que le PA se propage sans att é nuation tout au long de la fibre.). La propagation de la d é polarisation locale d é pend donc du diam è tre de l'axone. À ce propos, la gaine de my é line (isolante) des axones et ses noeuds de Ranvier (canaux Na+ Vm d é pendants : plusieurs milliers par µ m2. La Membrane) permet une conduction saltatoire de l'influx, soit une conduction rapide et é nerg é tiquement é conomique (excitation confin é e à de petites r é gions).

27 Période réfractaire absolue : Si un stimulus est porté immédiatement après la survenue dun PA, un second PA ne peut être généré. Les canaux sodiques ont été inactivés pendant la repolarisation. Il faut attendre une période au potentiel membranaire de repos avant quils puissent être ré ouverts par un stimulus Le neurone et le potentiel daction (PA) : les périodes réfractaires Période réfractaire relative : Après la période réfractaire absolue, le seuil est plus élevé que la normale pendant une courte période (10 ms). Il faut donc un stimulus plus fort que le 1 er pour engendrer un nouveau PA.

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29 LA POMPE Na / K / ATPase MAINTIENT LES CONCENTRATIONS IONIQUES EN K+ ET Na+ INTRA- ET EXTRACELLULAIRE CONSTANTES Si l'axone empli de Na+ radioactif est plong é dans un milieu contenant du dinitroph é nol (DNP), soit un inhibiteur du m é tabolisme cellulaire, le flux sortant de Na+ s'arrête, et ce de fa ç on r é versible : la sortie de Na+ est donc bien un ph é nom è ne actif li é à des processus m é taboliques Si l'axone empli de Na+ radioactif est plong é dans un milieu d é pourvu d'ions K+, le flux sortant de Na+ s'arrête é galement : la sortie de Na+ d é pend de la pr é sence d'ions K+ dans le milieu ([K+]e). Le mod è le, encore hypoth é tique, de la pompe Na+/K+/ATPase postule l'existence d'une prot é ine transmembranaire dont la partie externe aurait 3 sites de liaison : 2 sites pour les ions K+ et un site pour l'ouaba ï ne (bloquant de la pompe). - la partie interne de la prot é ine, situ é e vers le cytoplasme de la cellule, porterait le site de liaison de l'ATP et 3 sites de liaison pour les ions Na+. Chaque fois que 3 ions Na+ sont expuls é s de la cellule, 2 ions K+ entrent dans la cellule.

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31 Le neurone et le potentiel daction (PA) : propagation du PA ou influx nerveux le long de laxone Rôle de la myéline : conduction saltatoire Nœud de Ranvier Conduction saltatoire

32 Le neurone et le potentiel daction (PA) : propagation du PA ou influx nerveux le long de laxone Rôle de la myéline : conduction saltatoire Dans les axones myélinisés, la membrane de laxone est isolée du liquide extracellulaire par les couches de myéline, sauf aux nœuds de Ranvier où la membrane de laxone est en contact direct avec le liquide extracellulaire. Dans ce cas, un PA au niveau dun nœud de Ranvier réalise son circuit local avec le prochain nœud de Ranvier. Le PA saute dun nœud de Ranvier à lautre

33 MÂLE Rat mâle, vue ventrale, externe. FEMELLE Rat femelle, vue ventrale, externe

34 GROSSES LIGNES POINTILLÉES Coupure de la PEAU. Pincer le ventre, avec les doigts ou une pince et, avec les ciseaux, couper la peau de haut en bas (1). Au niveau des bras (2) et jambes (3), couper la peau latéralement. Bien dégager le scrotum (4). Avec les doigts, tirer fortement et retirer la peau et la placer dans les cotés. La faire tenir avec des aiguilles piquées dans le bac de cire. Si le temps le permet, bien dénuder les épaules et les cuisses et retirer la peau. PETITES LIGNES POINTILLÉES Coupure du MUSCLE. Couper avec des ciseaux, les muscles minces de la poitrine et du ventre (5). Être un peu plus à gauche, au niveau de la poitrine, de façon à couper les côtes et non le sternum. Couper latéralement au centre (6). Ne pas couper trop profondément, rester en surface, pour ne pas perforer les intestins. Bien dégager le scrotum (7)

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37 Système nerveux du rat

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