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High diversity of Rhodobacterales in the subarctic North Atlantic Ocean and gene agent transfer protein expression in isolated strains Diversité des Organismes.

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1 High diversity of Rhodobacterales in the subarctic North Atlantic Ocean and gene agent transfer protein expression in isolated strains Diversité des Organismes Marins UE 106 Bordeyne François Arias Ruiz Camilo Etude de publications Fu Y, MacLeod DM, Rivkin RB, Chen F, Buchan A, Lang AS 1 Marie Beauchamp 2010 Terre-Neuve 500 nm Jannaschia sp. CCS1

2 Procaryotes : Organismes majeurs de locéan Rhodobacterales : Classe des alphaprotéobactéries 1 famille et 26 genres Importance dans la communauté du bactérioplancton Role écologique majeur ! Présence dAgents de Transfert de Gènes (ou GTAs) DiversitéDiscussionExpression g5CritiqueIntroductionConclusion 2 Biers et al., nm GTAs chez Ruegeria pomeroyi DSS-3 Pourcentage de Rhodobacterales Profondeur (m) Bloom Nord Atl. Ocean Pacifique côtier Mer Méditerranée Buchan et al., 2005 Ruegeria sp. TM nm Jannaschia sp. CCS1

3 GTAs : Que sont-ils et quel est leur rôle ? Petites particules : environ 50 à 70 nm semblables à des bactériophages Transferts de parties de génomes entre bactéries Environ 4,5 kb Rôle : flux majeur de gènes : adaptations aux conditions environnementales => Rôle écologique majeur 100 nm Bactériophage lambda Schnos GTA chez Reugeria mobilis 45A6 50 nm McDaniel et al. DiversitéDiscussionExpression g5Introduction 3 CritiqueConclusion

4 Avantage : conservation des séquences Marqueur Objectifs Estimation de la diversité en Rhodobacterales de la communauté bactérienne Etude de lexpression de la protéine g5 chez différentes souches/espèces DiversitéDiscussionExpression g5Introduction Mise en évidence de 3 gènes : g2 : protéine terminase g5 : protéine majeur de la capside g9 : protéine majeure de la queue Cluster GTA 1 kb 10 kb g2 g5 g9 CysE chprecG Lang et Beatty, 2000, modifié 4 g5 : protéine majeur de la capside CritiqueConclusion

5 1000 km USA Groenland Canada Terre Neuve Pickatrail ® Lieu de prélèvements DiversitéDiscussionExpression g5Introduction 5 CritiqueConclusion 10 km Google Earth, U.S. Navy N N

6 Matériel et méthodes Création dOTUs 97 % didentité nucléotidique Phylogénie selon méthode de Neighbor-Joining Identité nucléotidique inter-OTUs : 44 – 97 % Diversité supérieure en été Résultats DiversitéDiscussionExpression g5Introduction 6 Séquence g5 CritiqueConclusion ParamètresÉtéHiverTotalChesapeake Nombre Clones Nombre dOTUs Indice de Shannon H3,711,59-H max = 2,39 Rhodobacter capsulatus Ordre du µm

7 Sulfitobacter Oceanibulbus Roseobacter denitrificans OCh114 Octadecabacter Loktanella Ruegeria pomeroyi DSS-3 Roseobacter sp. MED193 Rhodobacter capsulatus SB1003 Citreicella sp. SE45 Groupe externe DiversitéDiscussionExpression g5Introduction Fu et al., 2010 modifié 7 Echelle non représentative CritiqueConclusion Sulfitobacter sp. EE-36 Sulfitobacter sp. NAS-14.1 Sulfitobacter Loktanella sp. CCS2 Loktanella Oceanibulbus indolifex HEL-45 Oceanibulbus Octadecabacter antarcticus 307 Octadecabacter Ete Hiver

8 8 Sulfitobacter sp. EE-36 Sulfitobacter sp. NAS-14.1 Oceanibulbus indolifex HEL-45 Roseobacter denitrificans OCh114 Octadecabacter antarcticus 307 Loktanella sp. CCS2 Rhodobacterales bacterium HTCC2150 Ruegeria pomeroyi DSS-3 Phaeobacter sp. Y4I Roseobacter sp. MED193 Rhodobacter capsulatus SB1003 Groupe externe Citreicella sp. SE45 Fu et al., 2010 modifié Echelle non représentative DiversitéDiscussionExpression g5IntroductionCritiqueConclusion Sulfitobacter Oceanibulbus Octadecabacter Loktanella

9 DML-w6 DML-w13 DML-w12.1 DML-w4.2 DML-w8 Sulfitobacter sp. NAS-14.1 Roseobacter sp. GAI101 Oceanilbulbus indolifex HEL-45 Octadecabacter antarcticus 307 CB1023 CB1005 CB1040 Loktanella sp. CCS-2 Citreicella sp. SE45 Roseovarius sp. HTCC2601 Ruegeria pomeroyi DSS-3 Phaeobacter sp. Y4I Rhodobacter capsulatus SB1003 Roseobacter sp. MED193 Matériel et méthodes 10 souches/espèces testées + 3 témoins DiversitéDiscussionExpression g5Introduction 9 5 provenant de Terre-Neuve 3 provenant de la baie de Chesapeake 2 autres Echelle non représentative Fu et al., 2010 modifié Western blot CritiqueConclusion Poids moléculaire : g5 mature chez Rhodobacter capsulatus

10 DML-w6 DML-w13 DML-w12.1 DML-w4.2 DML-w8 Sulfitobacter sp. NAS-14.1 Roseobacter sp. GAI101 Oceanibulbus indolifex HEL-45 Octadecabacter antarcticus 307 CB1023 CB1005 CB1040 Loktanella sp. CCS-2 Citreicella sp. SE45 Roseovarius sp. HTCC2601 Ruegeria pomeroyi DSS-3 Phaeobacter sp. Y4I Rhodobacter capsulatus SB1003 Roseobacter sp. MED Expression de la protéine dans 60 % des cas (6/10) 4/5 pour les échantillons de Terre-Neuve 2/3 pour ceux de la baie de Chesapeake 0/2 pour Loktanella DiversitéDiscussionExpression g5Introduction kDa Rc g DSS Y41 SE Fu et al., 2010 Echelle non représentative Fu et al., 2010 modifié CritiqueConclusion Résultats Protéines matures

11 Adaptation aux environnements froids Période du bloom phytoplanctonnique Terre Neuve : de -1,5 à 16°C Baie de Chesapeake : de 1 à 26 °C Terre Neuve : mi Avril à fin Mai Baie de Chesapeake : fin Février à fin Mars Mer de Weddel, Antarctique Jean-Pierre Marro 50 km N Bloom phytoplanctonique, Terre Neuve NASA DiversitéDiscussionExpression g5Introduction 11 Diversité CritiqueConclusion Existence de microdiversité Nouveaux groupes = nouvelles caractéristiques écologiques ?

12 DiversitéDiscussionExpression g5Introduction 12 Expression g5 g5 mature formation du GTAs Mais aussi : Mauvaises conditions de croissance Seuil de détection trop élevé Possibilité daucune expression Acquisition de nouvelles caractéristiques : dégradation de molécules carbonées ou soufrés particulières, etc. CritiqueConclusion Monsieurben, modifié 50 nm McDaniel et al.

13 13 DiversitéDiscussionExpression g5IntroductionCritiqueConclusion GLRGLSLEGKALNSAVAAEG GLRGLELEGKAMSTAVAGDG GLRGLVLEGKALSTAVAGDG ALRGLELEGKSLSSAVAADG ALRGLTLEGKAMSTAINSDG GLRGLELDSKSMSTAVNSDG Rhodobacter capsulatus SB1003 Oceanibulbus indolifex HEL-45 Phaeobacter sp. Y4I Citreicella sp. SE45 Octodecabacter antarcticus 307 Ruegeria pomeroyi DSS-3 Zone de clivage Une autre évidence Conservation de la zone de clivage très importante Fu et al., 2010

14 DiversitéDiscussionExpression g5Introduction 14 Phylogénie g5 vs phylogénie ARNr 16S : non congruence Temps écoulé entre les 2 prélèvements Mise en évidence de bloom phytoplanctonnique estival par la NASA CritiqueConclusion Originalité du marqueur Rhodobacterales affectées par une eau contaminée Suivi de lévolution de la communauté en Rhodobacterales Europe 1 NASA 12/08/2002 Terre-Neuve N

15 DiversitéDiscussionExpression g5Introduction 15 CritiqueConclusion Difficulté de culture des souches/espèces Seulement 2 prélèvements, sans réplicats Comparaisons + diminution du risque dextrêmes Vitesse dévolution de la séquence g5 10 km Google Earth, U.S. Navy N Labrot ©

16 16 DiversitéDiscussionExpression g5IntroductionCritiqueConclusion Diversité en Rhodobacterales importante à Terre Neuve Mise en évidence dune nouvelle partie de la grande diversité de cet ordre Expression de protéines g5 matures chez plusieurs espèces Transferts et acquisition de gènes peuvent être réalisés Mais, de nombreux travaux restent à effectuer pour en connaitre encore et encore… Nombre dOTUs Nombre de clones Eté Hiver Fu et al., 2010 modifié Ordre du µm 50 nm 500 nm

17 17 Bibliographie Fu Y, MacLeod DM, Rivkin RB, Chen F, Buchan A, Lang AS (2010) High diversity of Rhodobacterales in the subarctic North Atlantic Ocean and gene transfer agent protein expression in isolated strains. Aquat Microb Ecol : Zhao Y, Wang K, Budinoff C, Buchan A, Lang A, Jiao N, Chen F (2009) Gene transfer agent (GTA) genes reveal diverse and dynamic Roseobacter and Rhodobacter populations in the Chesapeake Bay. The ISME journal (3) : Prabagaran SR, Manorama R, Delille D, Shivaji S (2007) Predominance of Roseobacter, Sulfitobacter, Glaciecola and Psychrobacter in seawater collected off Ushuaia, Argentina, Sub-Antarctica. FEMS Microbiol Ecol 59 : 342–355 Lang AS et Beatty JT (2000) Genetic analysis of a bacterial genetic exchange element: The gene transfer agent of Rhodobacter capsulatus. PNAS (97) : 859 –864 Ettema TJG et Andersson SGE (2009) The α-proteobacteria: the Darwin finches of the bacterial world. Biol. Lett. (5): Google Earth (Version 6.0) [Software]. Mountain View, CA: Google Inc. (2010). Disponible sur NASA Earth Observatory (2010) Phytoplankton bloom off Newfoundland. Novembre 2010http://earthobservatory.nasa.gov Buchan A, Gonzalez JM, Moran MA (2005) Overview of the marine Roseobacter lineage. Appl Environ Microbiol 71: 5665 – 5677 Biers EJ, Wang K, Pennington C, Belas R, Chen F, Moran MA (2008) Occurrence and Expression of Gene Transfer Agent Genes in Marine Bacterioplankton. Applied and environmental microbiology : 2933 – 293 Bergeys Manual of Systematic Bacteriology. Second edition. Volume 2 : The Proteobacteria. Part c : The Alpha-, Beta-, Delta- and Epsilonproteobacteria. (2005)

18 18 Merci de votre attention ! Terre-Neuve

19 19 High diversity of Rhodobacterales in the subarctic North Atlantic Ocean and gene agent transfer protein expression in isolated strains Diversité des Organismes Marins UE 106 Bordeyne François Arias Ruiz Camilo Etude de publications Marie Beauchamp Fu Y, MacLeod DM, Rivkin RB, Chen F, Buchan A, Lang AS nm Jannaschia sp. CCS1 Terre-Neuve

20 20 Cycles de PCR et primers utilisés Pour la séquence g5 Cycle : 30 s à 98 °C puis 35 cycles de 10 s à 98 °C, 30 s à 60 °C et 30 s à 72 °C, avec pour finir 7 min à 72 °C Primers : MCP-109F : 5-GGC TAY CTG GTS GAT CCS CAR AC-3 MCP-368R : 5-TAG AAC AGS ACR TGS GGY TTK GC-3 Pour la séquence ADNr 16S Cycle : 30 s à 98 °C puis 35 cycles de 10 s à 98 °C, 30 s à 58 °C et 30 s à 72 °C, avec pour finir 8 min à 72 °C Primers : 27F : 5-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG R : 5-AAG GAG GTG ATC CAN CCR CA-3 Questions

21 21 Base ou type de basescode à une lettre AdénineA ThymineT GuanineG CytosineC InosineI UracileU Purine : Adénine ou GuanineR Faible liaison (deux liaisons hydrogène) : Adénine ou Thymine W Fonction cétone dans le grand sillon de l'ADN : Thymine ou Guanine K Pas une AdénineB Pas une ThymineV Pyrimidine: Thymine ou CytosineY Forte liaison (trois liaisons hydrogène) : Cytosine ou Guanine S Fonction amine dans le grand sillon de l'ADN : Adénine ou Cytosine M Pas une CytosineD Pas une GuanineH QuelconqueN Base azotée : abréviations

22 22 Expérience de neutralisation d'anticorps TBST Tris-Buffered Saline Tween-20 Anticorps primaire Incubé avec un excès molaire (~100 plis du peptide d'immunisation) 2h en solution buffer (TBST) à T° ambient. Anticorps Control (Non neutralisé) Meme conditions sans adition de peptide Pour confirmer la détection des bandes spécifiquement reconnues par les anticorps primaires du GTA. Anticorps polyclonal dirigé contre un peptide synthétique correspondant à une région de la protéine majeure capsid (g5) GTA conservée à plus de 90 %. Détection de la présence d'une protéine dans un tissu, évaluation de la taille et la concentration. Avantage Anticorps du g5

23 23 Pourcentage de recouvrement Analyse de raréfaction C = 1 – (N/n) x 100 N : nombre de séquences uniques n : nombre total de clones But : calculer la proportion de la diversité entre les séquences Cette analyse permet destimer le nombre despèces présentent dans un échantillon à partir du nombre total dindividus.

24 24 Mécanisme de transfert de gènes chez les procaryotes Conjugaison Transformation bactérienne

25 25 Neighbor Joining Naccepte pas lexactitude de lhorloge moléculaire But : établir les relations phylogénétiques entre différents taxons, à partir dun indice de distance Obtention dun arbre non raciné Méthode danalyse phénétique Ici : méthode des distances the Maximum Composite Likelihood Method

26 26 Cellule eucaryote : 20 µm Bactérie : 2 µm GTA : 50 – 70 nm Taille moyenne des différentes structures

27 27 Position des alphaprotéobactéries dans le vivant Archae Eucaryotes Bactéries γ-protéobactéries β-protéobactéries α-protéobactéries ε-protéobactéries Cyanobactéries Firmicutes Planctomycètes Spirochètes Actinobactéries

28 28 Western blot Permet détudier la synthèse (ou non) de protéine utilisation de sonde : des anticorps Northern blot : permet de quantifier lexpression du gène Southern blot : permet de répondre à combien de gènes sont exprimés

29 29 Indice de Shannon H H = - pi ln(pi) i = Espèce du milieu pi = proportion de lespèce I dans le milieu 0 < H < ln S Mesure de la diversité dun milieu. Plus H est grand, plus la diversité est importante. Lindice est max quand toutes les espèces sont à égale proportion S = nombre despèces dans le milieu Source : Grall J. et Hily C.

30 30 Roseobacter vs Rhodobacterales Loktanella Octadecabacter - Ruegeria Sulfitobacter - Oceanibulbus Roseobacter Ruegeria Rhodobacter capsulatus Buchan et al., 2005

31 31 ORF : Open Reading Frames Séquence dADN qui permet destimer la présence dun gène Commence par un codon dinitiation et termine par un codon stop. Entre ces codons, on retrouve les codons codant pour la protéine la partie codante de lADN

32 32 ACIDE AMINE3 lettres1 lettreCodons AlanineAlaAGCA, GCC, GCG, GCT ArginineArgRCGA, CGC, CGG, CGT, AGA, AGG Aspartic acidAspDGAC, GAT AsparagineAsnNAAC, AAT CysteineCysCTGC, TGT Glutamic acidGluEGAA, GAG GlutamineGlnQCAA, CAG GlycineGlyGGGA, GGC, GGG, GGT HistidineHisHCAC, CAT IsoleucineIleIATA, ATC, ATT LeucineLeuLCTA, CTC, CTG, CTT, TTA, TTG LysineLysKAAA, AAG MethionineMetMATG PhenylalaninePheFTTC, TTT ProlineProPCCA, CCC, CCG, CCT SerineSerSTCA, TCC, TCG, TCT, AGC, AGT ThreonineThrTACT, ACC, ACG, ACT TryptophanTrpWTGG TyrosineTyrYTAC, TAT ValineValVGTA, GTC, GTG, GTT STOP--TAG, TAA, TGA Correspondance Acides aminés/abbréviations

33 33 Position phylogénétique non sûre En se basant sur lARNr 16S, Lee et al., proposent une taxonomie différente de celle du Bergeys Manual of Systematic Bacteriology. This studyBMSB Order Caulobacterales Family Caulobacteraceae Family HyphomonadaceaeOrder Rhodobacterales Family Rhodobacteraceae The hierarchical system of the Alphaproteobacteria: description of Hyphomonadaceae fam. nov., Xanthobacteraceae fam. nov. and Erythrobacteraceae fam. nov. Lee et al., 2005


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