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GMP, Paris, Février 20041 Autoradiographie quantitative danimaux entiers (QWBA) Alain A. Schweitzer, PhD PCS, Novartis Pharma AG, CH-4057 Bâle.

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1 GMP, Paris, Février Autoradiographie quantitative danimaux entiers (QWBA) Alain A. Schweitzer, PhD PCS, Novartis Pharma AG, CH-4057 Bâle

2 GMP, Paris, Février Sommaire Définitions Historique La méthode dUllberg Détection de la radioactivité Quantification des autoradiogrammes Interprétation des résultats Principales applications Conclusions

3 GMP, Paris, Février Définitions Ensemble de méthodes photographiques permettant la détection et la localisation spatiale/géographique déléments radioactifs présents dans un échantillon solide Macro- vs. Microautoradiographie QWBAR, QWBAL et DNC

4 GMP, Paris, Février Historique (autoradiographie) 1897 (Niepce de St Victor): 1 er autoradiogramme (sels duranium)

5 GMP, Paris, Février Historique (autoradiographie, suite) 1904 (London) : 1 ère application biologique de lautoradiographie

6 GMP, Paris, Février Historique (autoradiographie, suite) 1953: 1 ère utilisation des particules β - (Dziewiatkovski) 1954: WBAR des substances diffusibles (Ullberg) 1963: 1 ère tentative de quantification WBAR (Kutzim) 1975: Brévet (USA) des écrans-phosphore (Luckey) 1983: Comptage Nucléaire Direct (Jeavons) 1989: Autoradioluminographie (Miyahara)

7 GMP, Paris, Février Historique (coupes danimaux entiers) 1947 (Libby) : scie à ruban, 2-3 mm, souris 1954 (Ullberg) : microtome, 100 µm, en chambre froide 1959 (Cohen et al.) : microtome à congélation (CO 2 ) 1961 (Pellerin) : rape/fraise datelier, seulement 1 WBA 1962 (Martin et al.) : disque abrasif/perceuse, souris 1966 (Kalberer) : scie circulaire, 2-4 mm, chat, singe 1977 (Ullberg) : cryomicrotome, méthode actuelle

8 GMP, Paris, Février Historique (méthode de Kalberer, 1966)

9 GMP, Paris, Février La méthode dUllberg Congélation Enrobage Trimming Obtention des coupes Cryodessication

10 GMP, Paris, Février Congélation des animaux Azote liquide ?? Hexane-CO 2 solide – Souris min (

11 GMP, Paris, Février Enrobage

12 GMP, Paris, Février Le Leica CM3600 PLC

13 GMP, Paris, Février Le Leica CM3600 PLC

14 GMP, Paris, Février Atteinte du niveau de coupe ( trimming)

15 GMP, Paris, Février Obtention des coupes

16 GMP, Paris, Février La coupe

17 GMP, Paris, Février Détection de la radioactivité Autoradiographie, à laide de films (QWBAR) Autoradioluminographie/imagerie phosphore, à laide décrans-phosphore (QWBAL) Comptage nucléaire direct, dans le compteur

18 GMP, Paris, Février QWBA / Principe QWBAR

19 GMP, Paris, Février QWBA / Principe QWBAL

20 GMP, Paris, Février QWBAL / exemple de balayage

21 GMP, Paris, Février QWBAL / exemple de balayage /Cyclone

22 GMP, Paris, Février QWBAL / exemple de balayage /BAS5000

23 GMP, Paris, Février QWBA / principe DNC / MICAD

24 GMP, Paris, Février QWBA / principe DNC /BetaImager 2000

25 GMP, Paris, Février QWBA / comparaison QWBAL et DNC

26 GMP, Paris, Février QWBA / durées QWBAR, QWBAL et DNC

27 GMP, Paris, Février QWBA / analyse en temps réel DNC

28 GMP, Paris, Février QWBA / analyse en temps réel DNC

29 GMP, Paris, Février QWBA / comparaison QWBAL et DNC

30 GMP, Paris, Février QWBA : Résolution film

31 GMP, Paris, Février QWBA : Résolution PhosphorImager

32 GMP, Paris, Février QWBA : Résolution BetaImager QWBA : Résolution BetaImager ( 3 H, 14 C)

33 GMP, Paris, Février QWBA / DNC (résolution µ-Imager®)

34 GMP, Paris, Février QWBA : Quantification

35 GMP, Paris, Février Quantification Historique

36 GMP, Paris, Février Quantification Historique Kutzim (1963) 1 ère quantification des WBA par densitometrie

37 GMP, Paris, Février Quantification auto-absorption tissulaire ? caractéristiques des coupes ? conditions dexposition ?

38 GMP, Paris, Février Quantification : auto-absorption tissulaire Détecteur Source radioactive homogène Coupe (40 µm) dun rat non traité

39 GMP, Paris, Février Quantification TissusAbsorbance moyenne ± SD Foie Moelle osseuse Cerveau Rate Coeur Rein Glande salivaire Vesicule séminale Poumon Surrénale SANG Muscle Testicule/epididyme Os minéral Tissue adipeux Globe oculaire

40 GMP, Paris, Février Quantification : efficacité relative DNC

41 GMP, Paris, Février Quantification : épaisseur des coupes

42 GMP, Paris, Février Quantification : conditions dexposition

43 GMP, Paris, Février Quantification : conclusions Standardisation de toutes les étapes (coupe, exposition, balayage etc) nécessaire Utilisation systématique indispensable des standards de calibration

44 GMP, Paris, Février Quantification : DNC vs. LSC

45 GMP, Paris, Février Quantification : QWBAL vs. DNC

46 GMP, Paris, Février Interprétation des résultats vue densemble de la distribution de la radioactivité (substance + métabolites) dans tout le corps distribution régionale dans les tissus et structures contrôle visuel de labsence de contamination archivage permettant une re-lecture/contre-expertise analyses complémentaires possibles

47 GMP, Paris, Février Interprétation des résultats macro-, pas micro-autoradiographie (récepteurs!) radioactivité totale, pas une structure chimique donnée pharmacocinétique! importance des conditions expérimentales – purité radiochimique de la substance testée – LOD, LOQ – doses nominales, doses radioactives – métabolites volatiles, 3 H 2 0 ouvrir les yeux, voir large

48 GMP, Paris, Février Principales applications contribution à la sélection de molécules (PD,Tox) contribution à la sélection de formulations (Galénique) études ADME (PK) safety assessment (ex: passage transplacentaire) (Tox) estimation de la radio-exposition (hADME) dossiers denregistrement études spécifiques (BBB, affinité à la mélanine, résidus, mottled pattern etc)

49 GMP, Paris, Février Exemples dapplication

50 GMP, Paris, Février Exemples dapplication

51 GMP, Paris, Février Exemples dapplication

52 GMP, Paris, Février Exemples dapplication

53 GMP, Paris, Février Exemples dapplication

54 GMP, Paris, Février Exemples dapplication

55 GMP, Paris, Février Conclusions informations spécifiques, importantes nombreuses applications en recherche & développement (universités, industries pharmaceutiques et agro-alimentaires etc) difficultés techniques expertise nécessaire coût élevé des équipements radioactivité totale, macroscopie, animal

56 GMP, Paris, Février Remerciements H.Harlemann, G.Gross, O.Kretz A.Wach, P.Schnider

57 GMP, Paris, Février Merci pour votre attention !


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