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LA VIE TREPIDANTE DES ELECTRONS DANS LES ENZYMES DOXYDO-REDUCTION Patrick BERTRAND Professeur à lUniversité de Provence Aix-Marseille 1 Collège de France,

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1 LA VIE TREPIDANTE DES ELECTRONS DANS LES ENZYMES DOXYDO-REDUCTION Patrick BERTRAND Professeur à lUniversité de Provence Aix-Marseille 1 Collège de France, 8 avril 2009 P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09

2 S RED S OX A OX A RED e-e- S RED S OX A OX A RED e-e- e-e- e-e- e-e- site actif centres rédox ENZYME DOXYDO-REDUCTION COMPLEXE BIOENERGETIQUE Q quinone S RED + A Ox S OX + A RED H+H+ H+H+ e-e- P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09

3 LES PROPRIETES EXTRAORDINAIRES DES ELECTRONS CAS DUN ELECTRON LIBRE 0 0 x x x 0 (x,0) (x,t) Lélectron se délocalise spontanément A quelle vitesse ? x(t) t = 0 Instant t Probabilité de présence: ( (x,t) ) 2 P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09

4 UN PETIT CALCUL - électron (m e = 9,1 x kg) avec x 0 = 1Å x = 12 Å t = s x = 1,2 mm t = s - objet dun kilogramme avec x 0 = 0,1 mm x = 1mm pour t = 30 x ans (âge de lUnivers : 13 x 10 9 ans) x(t) = P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09

5 DANS LES MOLECULES, LES ELECTRONS NE SONT PAS LIBRES ! Charge négative : interagissent avec les noyaux et les autres électrons Mais très petite masse - délocalisation dans des orbitales moléculaires : notion de densité électronique - s adaptent instantanément aux variations de géométrie: vibrations moléculaires La densité électronique sétire et se contracte en suivant les mouvements des noyaux P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09

6 LES TRANSFERTS DELECTRONS A LONGUE DISTANCE A RED A OX B OX B RED état initial état final U énergie potentielle EaEa final initial QiQi Q*Q* QfQf QiQi QfQf Q* k P exp(- E a /RT ) géométrie ERER P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09

7 EXPRESSION DE LA CONSTANTE DE VITESSE Analyse plus détaillée (R. Marcus, Prix Nobel de Chimie 1992) U remplacé par G° (variation denthalpie libre standard de la réaction) G° = - E°, avec E° = E° B - E° A potentiels rédox standards P : facteur électronique : carré recouvrement des orbitales (distance et masse) P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09

8 ET LE TRANSFERT INVERSE ? A RED B OX A OX B RED k 1 et k -1 : même P et même E R, mais G° - G° k 1 /k -1 = exp(- G°/RT) k1k1 k-1k-1 état initial état final P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09

9 UNE PROPRIETE REMARQUABLE : VARIATION DE k 1 AVEC E° E° ln k 1 ERER ln k -1 0 A B k1k1 k -1 E°AE°A E°BE°B E° = E° B – E° A Dans les molécules biologiques : E° < E R ( 0,5 à 1 eV) régime « normal » : k 1 augmente avec E° pente = 1/2RT P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09

10 DES CHAINES DE TRANSFERT DELECTRON DANS LES ENZYMES Sazanov et al., Science (2005, 2006) LE COMPLEXE I MITOCHONDRIAL P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09

11 COMMENT OPTIMISER UNE CHAINE DE TRANSFERT DELECTRON ? UN MAILLON : A B k -1 E°AE°A E°BE°B E° = E° B – E° A k 1 / k -1 = exp( E°/ RT) k1k1 Pour privilégier le transfert de A vers B ( k 1 >> k -1 ) : E° >> RT à T = 300 K, E° = 100 mV k 1 /k -1 = 50 E° = 200 mV k 1 /k -1 = 2500 UNE CHAINE « DIRECTIONNELLE » A B k -1 E°AE°A E° A +100 mV C k -2 k1k1 k2k2 D k -3 k3k3 E° A +200 mV E° A +300 mV P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09

12 LE PRIX A PAYER Les électrons sur D ont perdu beaucoup de leur pouvoir réducteur La biosynthèse des centres rédox coûte cher aux organismes vivants A B k -1 E°AE°A E° A mV C k -2 k1k1 k2k2 D k -3 k3k3 E° A mV E° A mV LA SOLUTION : DIMINUER LE NOMBRE DINTERMEDIAIRES A B k -1 E°AE°A E° A mV k1k1 ? ACCEPTEUR transfert délectron à longue distance ACCEPTEUR LA NATURE PROCEDE -T- ELLE AINSI ? P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09

13 LA NATURE A TRES BIEN FAIT LES CHOSES DANS LES CENTRES REACTIONNELS DE LA PHOTOSYNTHESE Catalysent les réactions : D RED + A OX + D OX + A RED P D RED D OX A OX A RED e-e- e-e- e-e- e-e- h Les transferts doivent être extrêmement rapides pour que les électrons arrivent sur laccepteur énergie lumineuse P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09

14 LE CENTRE REACTIONNEL BACTERIEN P870 B QAQA QBQB H P H OX Q A OX P* H OX Q A OX P OX H RED Q A OX P OX H OX Q A RED h 10 9 s s s -1 (25 Å) 3 x s -1 5 x 10 9 s Å 13 Å 18 Å 10 4 s -1 e-e- h P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09

15 QUEN EST-IL DANS LES ENZYMES DOXYDO-REDUCTION « ORDINAIRES » ? LES CENTRES REDOX Les hèmes Les centres fer-soufre 2Fe-2S 3Fe-4S4Fe-4S P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09

16 Structure : Iverson et al., Science (1999) 2Fe-2S 4Fe-4S 3Fe-4S site actif : flavine La succinate deshydrogénase (Complexe II mitochondrial) 0 mV mV + 60 mV +30 mV - 80 mV succinate fumarate UQ UQH 2 UQ + 60 mV 13 Å 14 Å 13 Å ubiquinone e-e- P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09

17 2 H + H2H2 e-e- LES HYDROGENASES A NICKEL-FER cytochrome ox site actif : Ni-Fe 4Fe-4S 3Fe-4S mV + 65 mV mV cytochrome mV mV mV 12 Å cytochrome red Structure: Volbeda et al., Nature (1995) P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09

18 Que faut-il en déduire ? Les transferts délectrons limitent-ils lactivité des enzymes ? Les potentiels rédox mesurés sont-ils pertinents ? La théorie du transfert délectron doit-elle être révisée ? Il faut comparer - lactivité des enzymes - la vitesse des transferts délectron P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09

19 ACTIVITE DES ENZYMES DOXYDO-REDUCTION mélange (S RED, A OX ) A t = 0, on ajoute lenzyme et on mesure la vitesse initiale : v i = v i proportionnelle à [enzyme] : activité (M s -1 ) dépend de processus très variés - intermoléculaires : diffusion S RED site actif A OX site favorable au TE - intramoléculaires : chimie au site actif transferts de protons transferts délectrons centres rédox S RED A OX e-e- e-e- e-e- S OX A RED site actif P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09

20 LA CONSTANTE CATALYTIQUE k CAT S RED A OX e-e- e-e- e-e- S OX A RED Quand [S RED ] 0 et [A OX ] 0 assez grandes (saturantes) : V i ne dépend que des processus intramoléculaires V i = k CAT [enzyme] cycle catalytique E E1E1 E2E2 E3E3 E4E4 modèle cinétique k CAT = f(k 1, k 2, k -2, …) Si étapes quasi irréversibles : 1/k CAT = 1/k 1 + 1/k 2 + 1/k 3 + 1/k 4 + 1/k 5 Notion détape limitante k CAT = nombre de cycles par seconde k1k1 k2k2 k -2 P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09

21 LES LACCASES S RED e - (rapide) e-e- e-e- S OX O2O2 2H 2 O M RED M OX T1T mV pH 5 Substrats aromatiques E° très positifs médiateurs Champignons, plantes, insectes, bactéries Cu S met His N S cys N His site actif (Cu trinucléaire) E° à mV transfert délectron médiateur T 1 : limitant ? Etude bibliographique Enzymes peu spécifiques Applications biotechnologiques P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09

22 VARIATION DE k CAT EN FONCTION DE E° = E°(T1) – E°(med) E° ln k 1 ERER 0 k CAT (s -1 ) pente = 1/(2RT) médiateur (non phénolique) = ABTS E°= + 700mV, pH 5 Série de 10 laccases, même médiateur P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09

23 VARIATION DE k CAT EN FONCTION DE E° = E°(T1) – E°(med) ENSEMBLE DES DONNEES Une laccase (Polyporus pinsitus) E°(T1) = 790 mV Série de 24 médiateurs, pH 5 Kulys et al., JBIC (2000) ERER P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09

24 Le paramètre k CAT dépend de E° = E°(T 1 ) - E°(médiateur) Dépendance conforme « en moyenne » à celle attendue pour k (transfert électron) Grande dispersion par rapport à la moyenne : - Facteur électronique du transfert délectron ? - Autres facteurs, indépendants du transfert délectron ? LES TRANSFERTS DELECTRONS SONT-ILS LIMITANTS DANS LES LACCASES ? P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09

25 LE FLAVOCYTOCHROME b 2 DE Saccharomyces cerevisiae L-lactate pyruvate mV cytochrome ox cytochrome red mV F RED H OX lactate pyruvate + 2H + F SQ H RED F SQ H OX F OX H RED cyt ox cyt red cyt ox cyt red E H °- E 1 ° = 130 mV E° H = - 5 mV E H °-E 2 ° = 40 mV e-e- e-e- Expériences de saut de température sur formes sauvage et mutées k CAT = 160 s -1 (30°C, pH7) F OX H OX F RED E 1 °= mV F SQ E 2 °= - 45 mV F OX P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09

26 MESURE DES CONSTANTES DE VITESSE (16°C) E H °- E 1 ° k 1 E H °-E 2 ° k 2 Forme sauvage: 160 s mV, 170 s mV, 1500 s -1 Y143 F : 60 s mV, 50 s mV - Y254 F : 15 s mV, 27 s mV - lactate pyruvate + 2H + CONCLUSION : transfert délectron « partiellement limitant » k1 k1 k2k2 k CAT ( 30°C,pH7 ) Tegoni et al, Biochemistry (1998) F RED H OX F SQ H RED F SQ H OX F OX H RED P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09

27 2 H + H2H2 LES HYDROGENASES A NICKEL-FER site actif : Ni-Fe 4Fe-4S 3Fe-4S mV + 65 mV mV cytochrome mV mV Très courtisées actuellement - Production de H 2 à partir de H 2 O et énergie solaire. - Catalyseur dans biopiles H 2 /O 2 Pourquoi un centre de haut potentiel ? Pourquoi un ligand histidine ? Étape limitante ? P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09

28 3Fe-4S + 65 mV 4Fe-4S mV mV REMPLACEMENT DU CENTRE 3Fe-4S PAR UN CENTRE 4Fe-4S cytochrome mV cytochrome k CAT = 1050 s -1 k CAT = 366 s -1 N-His CONCLUSION : le centre [3Fe-4S] est « meilleur » ! Forme sauvage Forme mutée Rousset et al. PNAS 1998 P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09

29 - 350 mV REMPLACEMENT DU LIGAND HISTIDINE CYSTEINE cytochrome k CAT = 1050 s -1 N-His mV cytochrome k CAT 1 s -1 S-Cys + 65 mV CONCLUSION : le ligand histidine est essentiel ! Forme sauvage Forme mutée P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09

30 - 350 mV REMPLACEMENT LIGAND HISTIDINE GLYCINE cytochrome k CAT = 1050 s -1 N-His mV Gly + 65 mV cytochrome k CAT = 90 s -1 Mais k CAT = 540 s -1 avec 10 mM imidazole ! Confirmation de limportance du ligand histidine Forme sauvage Forme mutée Dementin et al, JACS 2006 P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09

31 CONCLUSION (PROVISOIRE) Hydrogénase: le transfert délectron est limitant dans les formes mutées Mais dans la forme sauvage ? Lefficacité dune chaîne de transfert délectron ne dépend pas seulement de lordre des potentiels rédox des centres Facteur électronique ? A suivre… P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09


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