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Les gènes PR-10 du pommier : identification, caractérisation et analyse de l’expression spatio-temporelle en réponse à une induction par l'acibenzolar-S-methyl.

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1 Les gènes PR-10 du pommier : identification, caractérisation et analyse de l’expression spatio-temporelle en réponse à une induction par l'acibenzolar-S-methyl (ASM). Presentation, PhD Thesis, Biology, Ecole doctorale de Rennes 1, France. Smaïl Ziadi © 2001 PR-10 genes in apple seedlings (Malus domestica): identification, characterization and spatio-temporal expression after induction by acibenzolar-S-methyl (ASM), a functional analogue of salicylic acid.

2 Les gènes PR-10 du pommier : identification, caractérisation et analyse de l’expression spatio-temporelle en réponse à une induction par l'acibenzolar-S-methyl (ASM). 1- Situation du sujet. 3- Objectifs. 5- Conclusion générale. 2- Présentation du modèle d’étude. 4- Résultats obtenus. 6- Perspectives. Ziadi © 2001

3 Réponse de la plante aux stress Plante Bactéries Champignons Virus Facteurs physiques et/ou chimiquesFacteurs de virulence et d’avirulence Eliciteurs abiotiques Eliciteurs biotiques Salinité Sécheresse Eliciteurs chimiques Blessure Stress 1 1 : Défense constitutive 2 2 : Défense inductible Ziadi © 2001

4 R eprésentation spatio-temporelle des réponses de défense de la plante Flux d’ions Burst oxydatif Cascade de phospho- rylation Mort cellulaire Temps relatif Rapide Point de stress Rapide/ intermédiaire Intermédiaire/ long Défense localeDéfense systémique Distance/site de stress Voies des phényl- propanoïdes Protéines PR HR Protéines Protéines PR PR Ziadi © 2001

5 Principales voies de signalisation BlessureInfection par un agent pathogène Production de l’AS Production de l’AJ et C 2 H Protéines PR non inductibles par l’AS Protéines PR inductibles par l’AS Protéines PR inductibles par toutes les voies de signalisation Ziadi © 2001

6 Définition des protéines PR* Protéines de la plante induites dans des : ou - Situations de pathologie. - Situations liées à la pathologie. l’application des éliciteurs chimiques. * van Loon et al., 1994 Ziadi © 2001

7 Classification des protéines PR FamillePropriétésSymboles des gènes PR-1InconnueYpr1 PR-2  -1,3-glucanase. Ypr2, [Gns2 (‘Glb’)] PR-3Chitinases type I, II, III, IV, V, VI, VIIYpr3, Chia PR-4Chitinase type I, IIYpr4, Chid PR-5Thaumatin-likeYpr5 PR-6Inhibiteur de protéinasesYpr6, Pis (‘Pin’) PR-7EndoprotéinaseYpr7 PR-8Chitinase type IIIYpr8, Chib PR-9PeroxydaseYpr9, Prx PR-10"Ribonuclease-like"Ypr10 PR-11Chitinase type IYpr11, Chic PR-12DéfensineYpr12 PR-13ThionineYpr13, Thi PR-14Protéine de transfert de lipidesYpr14, Ltp FamillePropriétésSymboles des gènes PR-1InconnueYpr1 PR-2  -1,3-glucanase. Ypr2, [Gns2 (‘Glb’)] PR-3Chitinases type I, II, III, IV, V, VI, VIIYpr3, Chia PR-4Chitinase type I, IIYpr4, Chid PR-5Thaumatin-likeYpr5 PR-6Inhibiteur de protéinasesYpr6, Pis (‘Pin’) PR-7EndoprotéinaseYpr7 PR-8Chitinase type IIIYpr8, Chib PR-9PeroxydaseYpr9, Prx PR-10"Ribonuclease-like"Ypr10 PR-11Chitinase type IYpr11, Chic PR-12DéfensineYpr12 PR-13ThionineYpr13, Thi PR-14Protéine de transfert de lipidesYpr14, Ltp van Loon et van Strien., 1999 Ziadi © 2001

8 La famille PR Identification basée sur l’homologie de séquences. 3- Particularités : 4- Induction : - Protéines PR acides intracellulaires - Pouvoir allergène 1- Poids moléculaire : 16 – 18 kDa. - Stress biotiques - Stress abiotiques - Stades physiologiques 5- Activité enzymatique suspectée : - Ribonucléase Ziadi © 2001

9 Modèle d’étude 1- Gènes candidats : 1- Gènes candidats : Gènes PR-10. Gènes PR Matériel végétal : 2- Matériel végétal : Pommier, semis du cv. Golden Delicious. Pommier, semis du cv. Golden Delicious. 3- Activateur de la résistance : 3- Activateur de la résistance : acibenzolar-S-methyl (ASM). acibenzolar-S-methyl (ASM). Ziadi © 2001

10 Les protéines PR-10 du pommier : connaissances actuelles 1- Famille multigénique a. 3- La majorité des travaux sont de type allergologique. 4- Analyse de la régulation du gène AP15 d. d Pühringer et al., Identification de 2 gènes : AP15 b et Mal d 1 c. b Atkinson et al., c Vanek-Krebitz et al., a Walter et al., Ziadi © 2001

11 Le pommier 1- Modèle de référence. - Mécanismes de défense a. - Cartographie du génome du pommier b. 2- Intérêt agronomique. a Laboratoire du Feu Bactérien, UMR PaVé, Angers. b European Apple Linkage Map : Prima x Fiesta. Ziadi © 2001

12 acibenzolar-S-methyl (ASM) 1- Analogue fonctionnel de l’acide salicylique a. 2- Activateur de la résistance de plusieurs plantes. 4- Nombreuses qualités pratiques. 3- Protège le pommier contre le feu bactérien. a Wendehenne et al., Analogue fonctionnel de l’acide salicylique a. Ziadi © 2001

13 acibenzolar-S-methyl (ASM): analogue fonctionnel de l’acide salicylique Acide salicylique AS ooHoH oHoH Acide 2, 6-dichloroisonicotinique INA ooHoH oHoH NCl Acibenzolar-S-methylASM o s N N S CH 3 Ziadi © 2001

14 Mode d’action de l’acibenzolar-S-methyl (ASM) Tissus non infectés Tissus infectés Nécroses Expression des gènes de défense Résistance Acquise Locale AcideSalicylique Signal systémique NahG Expression des gènes de la SAR Résistance Systémique Acquise nim1 npr1 nim1 npr1 AcideSalicylique ASM cpr1? lsd2 lsd4 ndr1? cpr1? cim2 cim3 Interaction plante-agent pathogène D’après Ryals et al., 1996 Ziadi © 2001

15 acibenzolar-S-methyl (ASM) 1- Analogue fonctionnel de l’acide salicylique a. 2- Activateur de la résistance de plusieurs plantes b. 4- Nombreuses qualités pratiques d. 3- Protège le pommier contre le feu bactérien c. c Brisset et al., b Ruess et al., a Wendehenne et al., d Godard et al., Ziadi © 2001

16 Objectifs de l’étude 1- Identification et caractérisation des gènes PR Analyse de l’expression spatio-temporelle des gènes PR-10 après application de l'acibenzolar-S-methyl (ASM). 3- Analyse de l’expression des gènes PR-10 après application d’autres stress abiotiques. 4- Localisation in situ des produits des gènes PR-10. Les gènes PR-10 du pommier Ziadi © 2001

17 Résultats obtenus Identification et caractérisation des gènes PR-10 du pommier Ziadi © 2001

18 Recherche des transcrits PR-10 RACE avec des amorces dégénérées Série de restrictions 4 classes d’inserts Séquençage d’un insert de chaque classe AP1, AP2, AP3, AP4 Ziadi © 2001

19 Analyse phylogénétique Séquences PR-10 du pommier Séquences PR-10 du bouleau Séquences PR-10 cv. Golden Delicious Séquences PR-10 proches du pommier pru Pyr pru Bet v 1-Sc1 Q9SYV6 Q9SYW3 Q9SYV3 P43211/Mal d 1 Q40280/AP15 Q9SYV2Q9SYV4Q9SYV5 Q9SYV7Q9SYV8Q9SYV9 Q9S7M5Q43549 Q43550 Q43551Q43552 Séquences AP AP1 AP3 AP4 AP2 Ziadi © 2001

20 Analyse phylogénétique APb APa Ziadi © 2001

21 R eprésentation des séquences génomiques EE MJ Ei W W W W ET T TT 500 pb1000 pb1500 pb AP2 AP3 AP4 tataaat tataaat tataaat +1 AP1 tataaat atg +555 taa atg +557 taa atg +732 taa aggc +268 aggt +73 atg +717 taa aggc +256 aggt APb APa Ziadi © 2001

22 Résultats obtenus Analyse de l’expression spatio-temporelle des gènes PR-10 du pommier Ziadi © 2001

23 R eprésentation des séquences génomiques 500 pb1000 pb1500 pb AP2 AP3 AP4 AP1 tataaat atg +555 taa tataaat atg +557 taa +816 tataaat atg +732 taa aggc +268 aggt tataaat atg +717 taa aggc +256 aggt APb APa Ziadi © 2001

24 Expression constitutive des gènes PR-10 F PTR APa APb FeuillesTigePétioles Racines R Ziadi © 2001

25 Analyse de l’expression inductible des gènes PR-10 Pulvérisation: -ASM (1 mM) -H 2 O Prélèvement : 0 h 8 h12 h16 h 20 h24 h48 h120 h Prélèvement Ziadi © 2001

26 Expression inductible des gènes PR-10 Expression locale Au niveau transcriptionnelAu niveau traductionnel 18 kDa 17 kDa Bet v 1 8 h24 h48 h8 h24 h48 h 17 kDa H2OH2OASM H HHAAA 8 h 24 h 48 h APa APb Ziadi © 2001

27 1159 AP3 Signature PR-10 Représentation schématique des séquences protéiques Hypothèse d’une modification post-traductionnelle AP1 AP4 APa AP2 APb Ck Pk Ck Signature PR-10 P-loop Ziadi © 2001

28 Expression inductible des gènes PR-10 Analyse de l’expression systémique Pulvérisation: -ASM (1 mM) -H 2 O Prélèvement : Protection des deux jeunes feuilles FNT FT - FT: feuilles traitées - FNT: feuilles non traitées 0 h 48 h 120 h Ziadi © 2001

29 Expression inductible des gènes PR-10 Expression systémique FT FNT HHAA 48 h 120 h APa APb Ziadi © 2001

30 Résultats obtenus Analyse de l’expression des gènes PR-10 après application d’autres stress abiotiques Ziadi © 2001

31 Résultats obtenus 1- Éthylène. 2- Acide jasmonique. 3- Blessure. 4- Capsicéine. Ziadi © 2001

32 Application d’autres stress abiotiques Éthylène HHH h 24 h48 h APa APb Ziadi © 2001

33 Application d’autres stress abiotiques Acide jasmonique (0,1 mM) et Capsicéine (1 µg.ml -1 ) HHCapAJ Cap 48 h 120 h APa APb Ziadi © 2001

34 Application d’autres stress abiotiques Blessure T APa APb TBBBT 8 h 24 h48 h Ziadi © 2001

35 Résultats obtenus Localisation des produits des gènes PR-10 du pommier Ziadi © 2001

36 Localisation in situ des transcrits PR-10 Xy Barre d’échelle : 25 µm Ei Pp Es Pl Ziadi © 2001

37 Localisation in situ des protéines PR-10 Ei Xy ESESESES Barre d’échelle : 25 µm Ei ESESESES PLPLPLPL Pp PH Ziadi © 2001

38 ConclusionsetPerspectives Conclusions et Perspectives Ziadi © 2001

39 Conclusions Identification et caractérisation des gènes PR Deux sous-classes : APa (AP1, AP4) et APb (AP2, AP3). 4- Chacun de ces gènes a une régulation complexe et différente. 3- Les gènes APa sont considérés comme nouvellement identifiés. 1- Quatre transcrits PR-10 ont été identifiés a dans les feuilles. a GeneBank data base: AY (Ypr10*Md.d). AY (Ypr10*Md.b)AY (Ypr10*Md.a) AY (Ypr10*Md.c) Ziadi © 2001

40 Conclusions Expression spatio-temporelle des gènes PR Expression après application de l’ASM : 4- Aucune expression après application de l’AJ et la capsicéine. 3- Expression suite à des blessures et l’application de l’éthylène. 1- Expression constitutive uniquement au niveau des racines. 1- Très forte au niveau local. 2- Significative au niveau systémique. Ziadi © 2001

41 Conclusions Localisation in situ des produits des gènes PR Les tissus conducteurs. 2- Les parenchymes palissadiques. Les tissus du phloème. SMAÏL ZIADI, PASCAL POUPARD, MARIE-NOËLLE BRISSET, JEAN-PIERRE PAULIN and PHILIPPE SIMONEAU. Characterization in apple leaves of two subclasses of PR-10 transcripts inducible by acibenzolar-S-methyl, a functional analogue of salicylic acid Physiological and Molecular Plant Pathology (2001) 58, Ziadi © 2001

42 Rôles suggérés pour les protéines PR Rôle dans le développement de la plante. 1- Rôle dans les mécanismes de défense. Ziadi © 2001

43 Perspectives Fonction biologique 1- Analyse de l’expression des gènes PR-10 du pommier après un stress biotique. 2- Localisation cellulaire des produits des gènes PR Cartographie des gènes PR Analyse de l’activité enzymatique des protéines PR-10. Ziadi © 2001

44 Aspect allergénique des protéines PR-10 Breiteneder et Ebner, 2000 Ziadi © 2001

45 Allergènes des aliments homologues aux protéines PR Allergènes homologues à Sources d’allergènes PR-2 fruits et légumes. PR-3 avocat (Pers a 1), châtaigne, banane. PR-4 navet. PR-5 cerise (Pru av 2), pomme (Mal d 2), poivron (P23). PR-10 Pomme (Mal d 1), cerise (Pru av 1), abricot (Pru ar 1), poire (Pyr c 1), céleri (Api g 1), carotte (Dau c 1), persil (pcPR), pomme de terre (pSTH). PR-14 pêche (Pru p 3), pomme (Mal d 3), graine de soja (Gly m 1), orge. Breiteneder et Ebner., 2000; Hoffmann-Sommergruber, 2000 Allergènes homologues à Sources d’allergènes PR-2 fruits et légumes. PR-3 avocat (Pers a 1), châtaigne, banane. PR-4 navet. PR-5 cerise (Pru av 2), pomme (Mal d 2), poivron (P23). PR-10 Pomme (Mal d 1), cerise (Pru av 1), abricot (Pru ar 1), poire (Pyr c 1), céleri (Api g 1), carotte (Dau c 1), persil (pcPR), pomme de terre (pSTH). PR-14 pêche (Pru p 3), pomme (Mal d 3), graine de soja (Gly m 1), orge. Ziadi © 2001

46 Aspect allergénique des protéines PR-10 H A50 A100A200 APa APb ASM Ziadi © 2001

47 Question ouverte Protection des cultures par l’application des éliciteurs chimiques Induction des protéines allergènes Risques pour les consommateurs ? Évaluation des risques allergéniques Ziadi © 2001

48 Perspectives Évaluation des risques allergéniques 1- Vérification de l’allergénicité des protéines AP. 3- Recherche d’autres activateurs de la résistance qui n’induisent pas ou faiblement les gènes PR Suivi de l’expression des gènes PR-10 dans les fruits avant et après application de l’ASM. Ziadi © 2001

49 Encadrement - M. SIMONEAU P. Laboratoire de Microbiologie Végétale - M. POUPARD P. Laboratoire de Microbiologie Végétale - Melle. BRISSET M. –N. Équipe du Feu Bactérien, Station de Pathologie Végétale - M. PAULIN J. –P. Équipe du Feu Bactérien, Station de Pathologie Végétale Ziadi © 2001

50 Merci pour votre attention Ziadi © 2001

51 Les gènes PR-10 du pommier : identification, caractérisation et analyse de l’expression spatio-temporelle en réponse à une induction par l'acibenzolar-S-methyl (ASM). Ziadi © 2001


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