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Méthodes danalyse de surface appliquées à létude de protéines dadhérence cellulaire Laurence Martel 19 décembre 2002 UMR 5819 CNRS-CEA-UJF Structures et.

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1 Méthodes danalyse de surface appliquées à létude de protéines dadhérence cellulaire Laurence Martel 19 décembre 2002 UMR 5819 CNRS-CEA-UJF Structures et Propriétés dArchitectures Moléculaires

2 Plan de lexposé Contexte : relations structure/fonction des protéines Méthodes danalyse de surface –Élaboration de monocouches de protéines –Techniques détude expérimentale Réflectivité X Ellipsométrie –Modélisation des courbes expérimentales Applications à létude de protéines dadhérence cellulaire –Présentation des cadhérines –Rôle du calcium –Interaction entre fragments Conclusions et perspectives

3 C-Cadhérine : résolution 0,308 nm (T. Boggon et al. 2002) Positions des atomes Relations structure/fonction des protéines Structure cristallographique de protéines obtenues à partir de Cristaux 3D par Rayons X résolution atomique (jusquà 0,1 nm) Objectifs de cette étude Développer une méthodologie pour étudier les interactions entre protéines immobilisées et protéines en solution Cristaux 2D par microscopie électronique à transmission ou AFM résolution ~ 1 nm Hypothèses sur la fonction de la protéine Formation de complexes de protéines –Immobilisation des protéines sur une surface Informations sur les interactions entre protéines Reconstruction 3D de la structure Enveloppe de la protéine Sticholysine II : résolution 1,5 nm ( Martin-Benito et al ) 1,2nm

4 Plan de lexposé Contexte : relations structure/fonction des protéines Méthodes danalyse de surface –Élaboration de monocouches de protéines –Techniques détude expérimentale Réflectivité X Ellipsométrie –Modélisation des courbes expérimentales Applications à létude de protéines dadhérence cellulaire –Présentation des cadhérines –Rôle du calcium –Interaction entre fragments Conclusions et perspectives

5 Élaboration de couches de protéines 1 ère Étape : Formation dune monocouche de lipides à la surface de leau –Dépôt de lipides ligands chélatant un ion Ni 2+ : Ni-NTA-DLGE –+ Lipides diluants pour la fluidité de la monocouche lipides ligands lipides diluants

6 Élaboration de couches de protéines 2 ème Étape : Injection de protéines Ancrage par liaison de coordination histidine-nickel Exemple: Injection de cadhérines-His 6

7 Exemple: Injection de fragments Élaboration de couches de protéines 3 ème Étape : Injection dautres protéines ou molécules dintérêt dans la sous-phase Étude des interactions entre protéines

8 3 ème Étape : Injection dautres protéines ou molécules dintérêt dans la sous-phase Élaboration de couches de protéines Étude des interactions entre protéines

9 Techniques détude expérimentale Informations recherchées Mesurer la quantité de protéines ancrées aux lipides –Sans marqueur –Sans transfert de la couche de protéines Suivi de lévolution en temps réel et in situ –Ellipsométrie à la surface de leau Résolution 0,5 mg/m 2 = 0,5 ng/mm 2 –Résonance des plasmons de surface sur surface solide Déterminer la structure verticale de la couche –Réflectivité des rayons X Résolution verticale 1 nm

10 1. Réflectivité des rayons X en incidence rasante Ligne de lumière Troïka II, ESRF ( Responsable O. Konovalov) GoniomètreCellule échantillon Faisceau synchrotron monochromatique

11 1. Réflectivité des rayons X en incidence rasante Mesure de lintensité réfléchie spéculaire Réflectivité I/I 0 Cas dune interface simple : Air-Eau q z -4

12 1. Réflectivité des rayons X en incidence rasante Réflectivité I/I 0 Cas dune couche sur un substrat : Lipides sur eau

13 1. Réflectivité des rayons X en incidence rasante –Monocouche de fragments de C- cadhérine –Lipides ligands Ni-NTA-DLGE Cas dune couche complexe sur un substrat : Protéines ancrées aux lipides sur eau Courbe de réflectivité complexe Avantage de lESRF : la brillance du faisceau synchrotron permet de mesurer jusqu à des vecteurs de diffusion q~0,5 Å -1 soit une résolution de ~6,5 Å Nécessité dune méthode danalyse des données avec un modèle du système étudié

14 2. Ellipsométrie Suivi des variations des angles ellipsométriques et en fonction du temps, de, de Relation entre la mesure et lindice de réfraction Cas des lipides sur l'eau Indice eau n=1.333 Paramètres des lipides : n=1.448 d=2,5 nm Mesure du rapport des coefficients de réflexion des polarisations p et s de la lumière autour de langle de Brewster

15 2. Ellipsométrie Suivi de ladsorption de C-cadhérine à une monocouche de lipides ligands Ni-NTA-DLGE [Ca 2+ ] = 0,5 mM Mesures angulaires après 2h, puis après 17h30 Conséquences –Non-linéarité de la variation de et de avec ladsorption à angle fixe –Interprétation des mesures cinétiques ? Problème soulevé pour une couche épaisse (>10nm) –Déplacement de la courbe ellipsométrique angulaire vers les grands angles 2h 17h30

16 Modélisation du système lipides+protéines Objectif : Comparer les données expérimentales avec une courbe théorique pour déduire les paramètres (, d) caractérisant le système Programmes de calcul : –Réflectivité X : Parratt32 (HMI Berlin), R. Ober Paramètres ajustables : densité électronique, épaisseur d, rugosité –Ellipsométrie (et Résonance de Plasmon de Surface) : ce travail Paramètres ajustables : indice de réfraction n, épaisseur d Système à N couches (, d) N Équations de Fresnel Simulation des courbes par un calcul matriciel dAbélès

17 Réflectivité des rayons X en incidence rasante Chaîne carbonée Tête polaire et groupement Ni-NTA Réflectivité I/I 0 Modèle de profil de densité électronique des lipides 2 couches : 7 paramètres d'ajustement (,d, ) AirEau

18 Réflectivité des rayons X en incidence rasante Modèle de profil de densité électronique dune monocouche de fragments de C-cadhérine 30 couches : d=0,7 nm, =0 nm 30 paramètres d'ajustement ( ) N

19 Réflectivité X : Aire sous le profil de densité électronique, lipides soustraits Comparaison ellipsomètrie et réflectivité X : masse adsorbée par unité de surface Masse de C-cadhérine adsorbée aux lipides Ellipsométrie [Ca 2+ ] = 0,5 mM Réflectivité X [Ca 2+ ] = 5 mM Après 2h : 6,0 ± 0,5 mg/m 2 Après 4h : 8,1 mg/m 2 Après 17h30 : 8,7 ± 0,5 mg/m 2 ~ 0,417 e.Å -3 : densité électronique moyenne de la protéine R em rapport masse / électron dans la protéine sèche Ellipsométrie : Approximation de De Feijter et al. (1978) dn/dc ~ 0,19 cm 3 /g : incrément dindice de la solution de protéine

20 Résultats Mises au point 1.Technique délaboration de monocouches de protéines 2.Techniques expérimentales danalyse de surface complémentaires 3.Modélisation du système en multicouches Ellipsométrie Mesure des angles ellipsométriques et Ajustement pour obtenir et Estimation de la masse adsorbée apparente de protéines ancrées aux lipides Mesures cinétiques : 1 point / 3 secondes Réflectivité des rayons X Mesure de lintensité réfléchie Ajustement pour obtenir le profil de densité électronique perpendiculaire à la surface Calcul de la masse de protéines adsorbée aux lipides Application à létude des interactions entre protéines dadhérence cellulaire

21 Plan de lexposé Contexte : relations structure/fonction des protéines Méthodes danalyse de surface –Élaboration de monocouches de protéines –Techniques détude expérimentale Réflectivité X Ellipsométrie –Modélisation des courbes expérimentales Applications à létude de protéines dadhérence cellulaire –Présentation des cadhérines –Rôle du calcium –Interaction entre fragments Conclusions et perspectives

22 Adhérence cellulaire et molécules d adhérence Exemple des cellules de lendothélium vasculaire Plusieurs familles de Protéines dAdhérence Cellulaire

23 Adhérence cellulaire et molécules d adhérence Famille des cadhérines –Glycoprotéines transmembranaires –Sur tous types de cellules –Différentes cadhérines selon les cellules : VE-cadhérine humaine ( Vascular Endothelium ) C-cadhérine de Xenopus –5 domaines extracellulaires homologues (EC) –12 ions Ca 2+ /cadhérine pour un bon repliement ~23nm

24 Interaction entre molécules d adhérence Interactions entre domaines extracellulaires de cadhérine parallèles et anti-parallèles Concentrations critiques en calcium Perz et al mM [Ca 2+ ] 0 0,05 0,5 1 pas dinteraction dénaturation cis trans

25 Problématique : interaction entre cadhérines? Quelle loi dassemblage entre les fragments extracellulaires de cadhérine ? Quels domaines impliqués dans les interactions cis et trans ? Modèles actuels daprès résolutions de structure 3D et études en solution C-cadhérine : Interactions trans selon 3 alignements (mesures de force de surface) E- et N-cadhérine : Interaction trans par domaines N-terminaux

26 Problématique : interaction entre cadhérines? VE-cadhérine : Formation dhexamères du fragment VE-EC1-4 modèle dinteraction trans Quelle loi dassemblage entre les fragments extracellulaires de cadhérine ? Quels domaines impliqués dans les interactions cis et trans ? Modèles actuels daprès résolutions de structure 3D et études en solution

27 Les protéines recombinantes étudiées C-cadhérine Collaboration Deborah Leckband - UIUC, Urbana Fragment principal : C-EC1-5 His VE-cadhérine Collaboration Danielle Gulino - IBS, Grenoble Fragment principal : VE-EC1-4 His ~19 nm Parties extracellulaires seulement ~23 nm

28 Objectif de létude des cadhérines Approche expérimentale Caractérisation de couches de cadhérines par ellipsométrie : masse adsorbée par réflectivité X : structure verticale 1) Variation de la concentration en calcium Suivi de la masse adsorbée Évolution de la structure des couches 2) Interactions entre fragments de différentes longueurs Questions posées Structure et alignement cis ou trans le long des complexes de C-cadhérine? le long des hexamères de VE-cadhérine?

29 Monocouche de C-cadhérine en présence de calcium Monocouche de fragments C-EC1-5His avec [Ca 2+ ] = 5 mM –Lipides ligands Ni-NTA-DLGE –Après 4 heures dincubation Épaisseur totale ~16 nm Modèle dinteractions des cadhérines dans la couche Complexes cis ou trans ? Daprès la structure de T. Boggon et al. (2002) Inclinaison moyenne de 50° / surface

30 Influence de la concentration en calcium sur une couche de cadhérines Cadhérine sensible aux variations de la concentration calcium ? Monomères ou complexes cis Complexes trans [Ca 2+ ] > 1 mM Perte de masse due à Décrochement de cadhérines Dissociation des complexes Pas de variation attendue - calcium [Ca 2+ ] < 0,5 mM

31 Influence de lagent chélatant dions divalents EGTA sur une monocouche de C-cadhérine Dissociation de complexes de C-cadhérine ABC Ellipsométrie : Suivi cinétique de et Masse apparente de protéine adsorbée [Ca2+] =10mM[EGTA]=10mM[Ca2+] =5mM -5%-17% 6,7 mg/m 2 5,8 mg/m 2 7,0 mg/m 2 CBA Perte de masse après lajout dEGTA La masse initiale de C-cadhérine est retrouvée à 95% par simple ajout de calcium 34% des fragments en complexes trans

32 Dissociation de complexes de C-cadhérine À partir dune couche élaborée sur forte concentration en calcium Dilution de la sous-phase Réflectivité X Conclusion Pertes de masse et déstructuration des couches de C-cadhérines Profils de densité électronique Perte de masse après dilution 30% de fragments en complexes trans -15% 6,4 mg/m 2 7,5 mg/m 2

33 Conclusion sur la C-cadhérine Cadhérines immobilisées sensibles au calcium Cadhérines inter-digitées dans la monocouche Dissociation de complexes trans de C-cadhérines Mais … Les fragments possèdent tous une étiquette histidine [Ca 2+ ] = 1 mM[Ca 2+ ] = 0,1 mM

34 Interactions entre fragments de VE-cadhérine Localisation des interactions entre cadhérine le long de la protéine ? Interactions établies en solution entre fragments identiques de VE-cadhérine (S. Bibert et al. 2002) Trois mélanges de fragments VE-EC1-4 et de fragments courts Rapport 1:100 (EC1-4:court) pour favoriser la formation de complexes mixtes en solution

35 Interactions entre fragments de VE-cadhérine Fragment 1-4 seul His 6

36 Interactions entre fragments de VE-cadhérine Épaisseur totale ~ 21 nm Hexamères en surface ? Fragment 1-4 seul ~19 nm ~23,3 nm His 6

37 Interactions entre fragments de VE-cadhérine Fragment fragment 1-3 His 6

38 Interactions entre fragments de VE-cadhérine Fragment fragment 1-3 Profil de densité électronique similaire au cas du fragment 1-4 seul His 6

39 Interactions entre fragments de VE-cadhérine Fragment fragment 2- 4 His 6

40 Interactions entre fragments de VE-cadhérine Fragment fragment 2- 4 Profil similaire à celui des lipides Pas d'interaction lipide-cadhérine Fragment 1-4 +fragment 1-3 His 6

41 Interactions entre fragments de VE-cadhérine Fragment fragment 3-4 His 6

42 Interactions entre fragments de VE-cadhérine Fragment fragment 3-4 Profil similaire à celui des lipides Pas d'interaction lipide-cadhérine Fragment 1-4 +fragment 2-4 Fragment 1-4 +fragment 1-3 His 6

43 Modèles dinteraction entre cadhérines Ancrage de protéines aux lipides dans le cas du mélange EC1-4/EC1-3 Pas dancrage de protéines aux lipides dans le cas des mélanges EC1-4/EC2-4 et EC1-4/EC3-4 Conclusion sur la VE-cadhérine Entre fragments de longueurs différentes Importance du domaine EC4 La formation de complexes bloque létiquette histidine Dans lhexamère ?

44 Conclusion sur la VE-cadhérine Modèles dinteraction entre cadhérines En plusieurs étapes ? Formation de complexes cis puis de complexes trans Mélange de complexes en surface ?

45 Sur la méthodologie développée Ellipsométrie –Nécessaire prise en compte de la non-linéarité de et de avec ladsorption (mesures à angle fixe) –Estimation quantité de matière adsorbée en surface, Résolution 0,5 mg/m 2 –Suivi de la quantité de matière adsorbée en temps réel Réflectivité des rayons X –Des profils de densité électronique complexes rendent compte de changements fins dans la couche de protéines Résolution ~ 1 nm (suivant la normale à la couche)Conclusions Sur létude des cadhérines Dissociation de complexes et déstructuration de la monocouche de C-cadhérine par appauvrissement de la sous-phase en calcium Il existe des complexes anti-parallèles totalement enchevêtrés en surface Importance du domaine EC4 dans les interactions entre fragments de VE-cadhérine Hexamères en surface ?

46 Perspectives Étude des Cadhérines –Étude des interactions entre cadhérines immobilisées avec Un plus grand nombre de fragments courts différents Fragments sans étiquette histidine –Structure de complexes cristallisés à 2 dimensions (VE-cadhérine : thèse R. Al-Kurdi) –Questions ouvertes Observations de différences daffinités en surface et en volume Faible action de lagent chélatant EGTA sur le nickel des lipides ligands ? Modélisation de la Réflectivité X –Améliorer la modélisation en tenant compte de Couches dépaisseurs variables Conservation du nombre délectrons dans une couche Monocouche de protéines sur Surfaces Solides –Manipulation des échantillons facilitée –Étude par Résonance de Plasmons de Surface et Réflectivité de rayons X durs

47 Perspectives Appareil de mesure de la Résonance de Plasmons de Surface


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