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LES BACTERIES LES PLUS IMPORTANTES A CONNAITRE. 2 Les bactéries ayant une importance en pathologie animale ou végétale ou en technologique Classification.

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1 LES BACTERIES LES PLUS IMPORTANTES A CONNAITRE

2 2 Les bactéries ayant une importance en pathologie animale ou végétale ou en technologique Classification simplifiée des bactéries Les bactéries responsables de Toxi Infections Alimentaires Collectives Les germes daltération ou responsables de pathologies non alimentaires Les bactéries des fermentations alimentaires Les associations plantes-bactéries Les bactéries pathogènes des végétaux et leur implication dans les OGM Les bactéries probiotiques Les bactéries utilisées ou potentiellement utilisables en biotechnologie

3 3 Classification des principales bactéries Les bactéries ou Eubactéries présentent une grande diversité, malgré des caractéristiques phénotypiques simples. Une première division sépare les bactéries à Gram négatif et celles à Gram positif. A lintérieur de chacun de ces groupes figurent des familles regroupant des genres dont les caractéristiques sont semblables : exemple « Les bactéries à Gram négatif aérobies à microaérophiles, mobiles, spiralées ou vibrioïdes » Mais ces appellations regroupent parfois des genres bactériens sans aucune affinité. Une description des bactéries les plus importantes pour votre culture scientifique va suivre. Mais à tire de repère vous trouverez en diapo 4 et 5, un tableau présentant une classification simplifiée des deux grands groupes : bactéries à Gram négatif et bactéries à gram positif

4 4 Classification simplifiée: Gram négatif groupefamilleespèces Les SpirochètesBorrelia Les bactéries à gram négatif aérobies à microaérophiles, mobiles, spiralées ou vibrioïdes Campylobacter Aquaspirillum Les bactéries à Gram négatif incurvées peu ou pas mobiles Les bacilles et coques à Gram négatif aérobies Pseusomonadaceae Azotobacteriaceae Rhizobiaceae Nitrobacteriaceae Acetobacteriaceae Legionellaceae Neisseriaceae Pseudomonas, Alcaligenes Rhizobium, Agrobacterium Acetobacter Nitrobacter, Nitrosomonas Legionella Neisseria Les bacilles anaérobies facultatifs à Gram négatif Enterobacteriaceae Vibrionaceae Pasteurellaceae Escherichia coli, Salmonella Vibrio Les bacilles anaérobies à Gram négatif droits, courbes ou hélicoïdaux Les bactéries dissimilatrices des sulfates ou réductrices du soufre Les Rickettsies et Chlamydies Les mycoplasmes Les endosymbiontes

5 5 Classification simplifiée: Gram positif groupefamilleespèces Les coques à Gram positifMicrococcaceae Deinococcaceae Autres Genres de coques Micrococcus Staphylococcus Enterococcus Les Coques et Bacilles à gram positif formant des spores Bacilles Clostridies Bacillus cereus B.thuringiensis B. stearothermophilus B. thermoacidodurans ou coagulans Clostridium acetobutylicum Clostridium perfringens Les Bacilles à Gram positif réguliers ne formant pas de spores Lactobacilles Listeria et Brochothrix Lactobacillus delbrueckii Lactobacillus acidophilus Lactobacillus casei Lactobacillus plantarum Listeria Brochothrix Les Bacilles à Gram positif irréguliers ne formant pas de spores Corynebacterium : Propionibacterium Bifidobacterium Les Mycobactéries Les Nocardiomorphes Les bactéries dissimilatrices des sulfates ou réductrices du soufre

6 6 Les bactéries responsables de TIAC: Toxi Infections Alimentaires Collectives Une toxi infection alimentaire résulte de la multiplication des bactéries dans le tube digestif de lhôte où elles libèrent des toxines. Une intoxination est une pathologie qui résulte de lingestion dune toxine préformée dans laliment, que les cellules bactériennes soient encore présentes ou non, viables ou non. Une intoxication est due à lingestion de molécules toxiques liées à la présence de bactéries mais qui ne sont pas forcément des toxines bactériennes sensus stricto, comme par exemple des amines biogènes provenant de la protéolyse des tissus eucaryotes par des bactéries.. Les Toxi infections alimentaires collectives Lorigine des contaminations alimentaires peut-être tellurique ou hydrique, les germes peuvent être aussi véhiculés par voie aérienne dans les poussières ou être naturellement présents dans les aliments, en particulier sur la peau et les muqueuses des animaux ou lépiderme des végétaux. Les microorganismes du tractus digestif, dont bon nombre dEntérobactéries, restent vivants dans les faecès et constituent la flore fécale. Ils peuvent contaminer les aliments au cours des manipulations, éviscérations, découpes à labattoir, mais aussi via le contact des manipulateurs ou des surfaces ou instruments de travail, lors de préparations ultérieures. Ce sont aussi souvent ces mêmes germes que lon retrouve dans le sol ou les eaux insuffisamment traitées. Dans le tractus digestif les principales bactéries responsables de TIAC sont Escherichia coli, Salmonella, Shigella et Yersinia parmi les entérobactéries, Campylobacter, mais aussi des Streptocoques ou Enterocoques. Il faut distinguer les salmonelloses dues à des infections par des salmonelles autres que typhi ou paratyphi responsables de typhoïdes essentiellement dans les pays où les eaux ne sont pas traitée. (pays en voie de développement, camps de réfugiés, pays victimes dinondations graves) La peau et les muqueuses sont plus souvent porteuses de Microcoques, Staphylocoques, Pseudomonas…. Les légumes sont souvent contaminés par des Erwinia (entérobactéries) des Pseudomonas ou ou des bacilles sporulés : Bacillus cereus, Clostridium.

7 7 Les Toxi infections alimentaires collectives Etat des lieux sur les risques alimentaires De 1996 à 2003, les statistiques publiées révèlent presque 4400 épisodes de toxiinfections alimentaires pour environ 10 fois plus de personnes atteintes. En effet toutes les personnes atteintes ne font pas lobjet de déclaration : symptômes bénins, automédication…. Contrairement à ce quon pourrait penser cest la restauration familiale qui est le plus grand pourvoyeur de TIAC : presque 40% des cas déclarés. Les agents responsables sont dabord les salmonelles pour 41% des cas, puis Staphylococcus aureus pour 18% et Clostridium perfringens pour 16%. Les autres germes responsables de TIAC du moins en France sont variés. Aux USA, Campylobacter est le principal agent responsable de TIAC. Actuellement deux pathogènes sont en progression : Yersinia et E.coli O157 ;H7 Salmonella (hors typhi) Staphylococcus aureus Clostridium perfringens Bacillus cereus Histamine Campylobacter, Listeria Clostridium botulinum E.Coli 0:15,H:7 Yersinia Cryptosporidies, virus

8 8 Les facteurs de virulence chez les bactéries pathogènes Pour que des bactéries soient pathogènes, donc responsables de TIAC ou IA, elles doivent posséder trois caractéristiques essentielles : la capacité dadhérer aux cellules de lhôte, la production de substances toxiques et la capacité à la chélation du fer et éventuellement la capacité à envahir lhôte infecté. Les systèmes dadhésion Les systèmes dadhésion sont en général associés à des gènes plasmidiques et à la production de fimbriae ou pili de nature protéique, ils peuvent aussi être constitués par des polysaccharides de la surface externe des bactéries qui soit sont reconnus par des sites récepteurs à la surface des cellules de lhôte, soit reconnus par le système immunitaire. peptidoglycane espace périplasmique protéines lipide A polysaccharide

9 9 Adhésion, adhésion-effacement Le protocole dadhésion-effacement emprunté par les Escherichia coli entéropathogènes est complet et peut servir à illustrer le comportement des bactéries en général même si toutes les bactéries nutilisent pas strictement le même protocole.les bactéries adhèrent aux cellules de lhôte, provoquent des modifications morphologiques et fonctionnelles de la membrane des cellules de lhôte Les bactéries adhèrent aux microvillosités des cellules de lépithélium intestinal, mais on ne sait pas encore à ce jour par quelle structure : fimbriae ou capsule. Elles synthétisent alors des protéines ESP secrétées par des systèmes de secrétion de type III qui ancrent la bactérie à la cellule épithéliale. Parmi ces Esp pour E.coli Secreted Protein EspA compose un filament creux qui permet linjection dune protéine spécifique. Système de secrétion de type III EspA: filament adhésif creux EspB-D: protéines secrétées par Esp A formant un pore dans la membrane de lhöte Daprès Wales, Woodward, Pearson, 2005 J. Comp. Path

10 10 Adhésion, adhésion-effacement La bactérie secrète deux autres protéines:Tir pour Translocator intimine Receptor, qui sincorpore à la membrane de la cellule épithéliale et lintimine (gène eae). La bactérie secrète deux autres protéines:Tir pour Translocator intimine Receptor, qui sincorpore à la membrane de la cellule épithéliale et lintimine (gène eae). Lincorporation de Tir dans la membrane de la cellule intestinale déstabilise le cytosquelette qui maintenait la forme des microvillosités. Les microvillosités seffacent. Lintimine vient adhérer à son récepteur: Tir ce qui stabilise ladhésion de la bactérie pathogène à la cellule de lhôte. De plus lactine composant le cytosquelette est réorganisé pour former un piédestal lié à Tir. A ce stade le processus dattachement-effacement est complet. Les échanges ioniques et les flux deau sont alors perturbés ce qui se manifeste sous la forme dune diarrhée (cas des entéropathogènes) Filament dactine du cytoquelette intimine Tir

11 11 Les toxines Les produits toxiques sont de deux origines : les endotoxines : constituant normal des parois bactériennes LPS et les exotoxines : molécules excrétées par les bactéries dans certaines conditions. Les endotoxines Elles déclenchent essentiellement des réponses de type immunitaire : inflammation des tissus, élévation de la température. Ces réponses constituent le « choc septique », lors de lingestion massive dendotoxines entraînant des conséquences graves sur tous les organes et en particulier sur le système cardiovasculaire. Les endotoxines sont constituées par le LPS, dont la partie polysaccharidique confère la solubilité dans les liquides organiques, alors que le lipide A serait la partie toxique, immunogène. Ces endotoxines ont été particulièrement bien étudiées chez E. coli, Shigella et Salmonella. Ces molécules très stables, résistantes à la chaleur sont libérées lors de la lyse des bactéries et la destruction des membranes externes. Lipide A noyau central Chaîne polysaccharidique flottante abéquose, colitose Antigène O Acides gras courts 12 à 14 C Lipide A

12 12 Les exotoxines Elles sont variées et ont des fonctions spécifiques. Elles peuvent agir comme des phospholipases, (Legionelles, Staphyloccus ) capables daltérer lintégrité des membranes cytoplasmiques ou former des pores dans la membrane, ce qui induit la fuite des électrolytes intra cellulaire et la mort des cellules : cest le cas pour la plupart des hémolysines, en particulier pour les hémolysines des E. coli O157,H7, qui sont entérohémorragiques : EHEC. Elles peuvent aussi sattaquer au système immunitaire soit en hydrolysant de manière spécifique les immunoglobulines (Nesseria) soit en neutralisant la réponse immunitaire : cas des Légionelles qui inhibent le métabolisme respiratoire des cellules et la libération de H 2 O 2 ; ou jouer le rôle de super antigène qui suractive le système immunitaire et provoque un emballement de celui-ci comme avec lentérotoxine de Staphylococcus aureus. Enfin chez certains Escherichia coli, des toxines semblent responsables de lésions nécrosantes de la paroi intestinale : maladie de Crohn, voire peut-être aussi du syndrome de mort subite du nouveau-né. Une classe de toxine est très étudiée, il sagit des entérotoxines ou toxines excrétées par des bactéries pathogènes entériques. Les différents stratégies des Escherichia coli pathogènes vont servir de base à la compréhension des mécanismes daction des entérotoxines

13 13 Les entérotoxines ou exotoxines des entérobactéries Les différents stratégies des Escherichia coli pathogènes vont servir de base à la compréhension des mécanismes daction des entérotoxines. EPEC: Escherichia coli entéropathogènes EIEC: Escherichia coli invasives ETEC: Escherichia coli entérotoxinogènes EHEC: Escherichia coli entérohémorragiques Les Escherichia coli entéropathogènes EPEC ne dépassent pas le stade dadhésion –effacement. Les Escherichia coli entéroinvasives EIEC passent la barrière intestinale pour envahir tout lorganisme Les Escherichia coli entérotoxinogènes ETEC secrètent des toxines qui perturbent le métabolisme des cellules de la muqueuese intestinale Les Escherichia coli entérohémorragiques EHEC secrètent des toxines qui migrent dans le système sanguin

14 14 E.coli entérotoxinogènes et entéroinvasives Pour les ETEC (enterotoxinogènes) la multiplication des bactéries provoque la libération de lentérotoxine de type cholérique. La toxine se fixe à un récepteur lipidique de la membrane de de lhôte, sinternalise en finalement active ladénylate cyclase. Laugmentation du niveau dAMP cyclique induit une sécrétion active de chlorure et de carbonate hors des cellules de la muqueuse intestinale, et bloque lentrée normale de sodium à partir de la lumière intestinale en direction du sang. Le déséquilibre ionique entraine un flux deau au niveau des cellules de lintestin grêle qui nest pas compensée par la réabsorption de leau au niveau du gros intestin. Lensemble de ces déséquilibres conduit à des pertes deau massives et donc une déshydratation extrême de lorganisme entier, qui peuvent entraîner la mort dans le pire des cas, des lésions irréversibles des reins chez les jeunes enfants et des attaques neuronales chez les personnes âgées. Les EIEC (entéro invasives), sont capables de pénétrer par les vésicules dendocytose, dans les cellules de lhôte et de sy multiplier. Ces bactéries vont traverser les faces internes des membranes des cellules épithéliales puis envahir tout lorganisme. La réponse de lorganisme est alors de type inflammatoire. EIEC

15 15 Les entérohémorragiques: type E.coli 0:157;H7 Les EHEC entérohémorragiques se multiplient et libèrent des exotoxines de type shiga-like-toxin ou verotoxine (Stx) qui sinternalisent dans les cellules épithéliales de lintestin et en modifient le métabolisme jusquà la mort de ces cellules. La toxine peut aussi sinfiltrer entre deux cellules. Verotoxine nom actuel: toxine qui tueles cellules Vero en culture verotoxine (très grossie) Polynucléaires Macrophages La toxine Stx inhibe la synthèse des protéines par un mécanisme spécifique : en inactivant la sous- unité 60S du ribosome, chez les cellules eucaryotes. Linhibition est indépendante de lactivité peptidyl transférase. Stx inhibe la fixation de lamino-acyl ARNt sur le ribosome Purified Stxs have also been shown to induce apoptosis of epithelial and endothelial cells in vitro, Microbial Pathogenesis 38 (2005) 63–76 Lisa M. Harrison,

16 16 Polynucléaires Macrophages Vaisseau sanguin Les entérohémorragiques: type E.coli 0:157;H7 Laction de la verotoxine et la libération de LPS à partir des cellules invasives lysées induit une réponse immunitaire ( cytokines, interleukines, anti-corps) et inflammatoire qui peut se généraliser au système sanguin, rénal et finalement au cerveau. Thrombose Interleukine Cytokines, TNF

17 17 Les sidérophores Les sidérophores sont des systèmes particulièrement performants de chélation du fer. Le fer, est très abondant dans lenvironnement, mais en général sous une forme non utilisable par les bactéries : oxydes ou hydroxydes, les ions Fe3+ ne dépassent pas une concentration de mM à pH physiologique. Les sels ferreux peuvent atteindre jusquà 100mM en anaérobiose. Les sidérophores sont des composés capables de se lier très fortement au fer III et de le transporter, et pour certains dentrer en compétition avec les systèmes de chélation du fer de lhôte : transferrine dans le sang, lactoferrine dans le lait. Ce sont des molécules de faibles masses molaires, dont laffinité pour le fer III peut atteindre Ils sont libérés dans le milieu extérieur et vont à la conquête de fer. porine ? ou Ils sont ensuite reconnus par des récepteurs membranaires de la membrane externe et traversent cette membrane par les porines chez les bactéries à Gram négatif, comme les Pseudomonas. Le ferri-sidérophore traverse la membrane cytoplasmique; dans le cytoplasme le fer III est réduit dans le cytoplasme en fer ferreux, libéré dans le cytoplasme. Le sidérophore a une très faible affinité pour le fer ferreux, ce qui rend le mécanisme facile. Le sidérophore ressort dans le milieu extérieur et reprend le cycle précédent.

18 18 Stockage du fer : bactérioferritines Le fer ne reste pas libre dans le cytoplasme mais est stocké dans les bactérioferritines. Ce sont des boîtes creuses protéiques de 9 à10 nm de diamètre constituée de 24 sous-unités de 15 à 18 kD. Une sous-unité sur deux contient un groupement protohème, très proche du cytochrome b et un site catalytique ferroxydase. Lensemble est percé de trous par lesquels le fer peut entrer et être stocké sous forme dhydroxydes et de phosphates de fer III (jusquà 4500 unités métalliques par molécule de ferritine). Le fer entre et sort sous forme fer II, il est donc oxydé lors de son entrée et réduit lors de la libération. La ferritine sert aussi vraisemblablement au stockage du phosphate Sous-unité de bactérioferritine hème Unité de bactérioferritine Fer II hème

19 19 Les bactéries à Gram négatif Campylobacter Pseudomonas Les Entérobactéries Escherichia coli Salmonella Shigella Les Vibrionacées

20 20 Campylobacter Cest une bactérie spiralée thermotolérante qui pousse à 42-43°, microaérophile, oxydase positive, qui nacidifie pas le milieu à partir de sucre. Elle est mobile au moyen de flagelles polaires, ne se développe pas aux températures habituelles de conservation des aliments, elle ne résiste pas au dessèchement, aux bas pH, ni à des taux doxygènes élevés, elle est stimulée par une augmentation de la teneur en CO2, ce qui pose des problèmes pour sa détection Aux USA, en 2003 cette bactérie représente un grave risque sanitaire, les infections à Campylobacter déclarées sélèvent à cas par an soit 5 à 11% des intoxications alimentaires, et une estimation de 2 à 4 millions de personnes atteintes sans gravité. 500 décès par an sont dus à cette bactérie.(http://foodbornillness.com, oct 2009)http://foodbornillness.com En France il ny a pas eu de gros problème lié à la présence des Campylobacter, il y en a par contre en Angleterre La contamination se fait essentiellement par la consommation de viande de volaille insuffisamment cuite notamment au barbecue ou de lait cru. Cest un contaminant très fréquent des viandes en particulier, volailles et porcs, elle fait partie de la flore du tube digestif des animaux qui ne sont en général pas affectés par sa présence, mais peut entrainer lavortement du bétail, des hépatites chez les volailles, ou lentérite hémorragique chez le porc. En France 100% des carcasses de volailles peuvent être contaminées, ainsi que 70% des carcasses de porcs.. Des troubles se produisent lors de lingestion de 500 à plusieurs milliers de cellules et souvent chez les enfants jeunes<3 ans, ce sont des nausées des vomissements et des diarrhées qui apparaissent entre 2 et 5 jours après ingestion. Les troubles sont dus à la sécrétion dune toxine mais aussi au fait que cette bactérie peut-être invasive. Au moins deux exotoxines sont produites, dont une thermolabile ou entérotoxine et une cytotoxine. L'entérotoxine est une protéine de 60 à de poids moléculaire, inactivée à 56°C en 1 h ou à 96°C en 10 mn, partiellement inactivée à pH 4 et complétement détruite à pH 2 et 8. Cette toxine provoque une inactivation de ladénylate cyclase (fuite des chlorures des cellules envahies et un afflux deau dans le tube digestif).

21 21 Pseudomonas Ce sont des bacilles droits ou incurvés mais pas vibrioïdes, longs de 1,5 à 4 µm, mobiles au moyen de flagelle polaire simple ou multiple. Leur métabolisme est exclusivement respiratoire, jamais fermentaire même si elles produisent un peu dacide à partir des sucres en aérobiose. De nombreux Pseudomonas dont aeruginosa et certains fluorescens réalisent la respiration nitrate.. Elles sont hétérotrophes, toujours catalase positive et le plus souvent oxydase positive, elles ne possèdent pas de pigment photosynthétiques mais peuvent produire des pigments. Elles ne produisent pas dindole à partir de tryptophane, nacidifient pas le milieu au test rouge de méthyle et ne produisent pas dacétoïne Ce sont des pathogènes opportunistes, cest à dire qui infectent en général un organisme déjà affaibli, et dont les réponses immunitaires sont amoindries. Elles sont plus souvent des germes daltération que réellement responsbales de TIAC Lagent principal de virulence des Pseudomonas est la présence dexotoxines, cest à dire de molécules secrétées par les bactéries. En général ces exotoxines sont des phospholipases qui altèrent la couche phospholipidique des membranes cellulaires et forment des pores. Laltération de la membrane provoque une fuite des liquides cytoplasmiques et la mort des cellules. Ceci entraine une réponse de type inflammatoire de la part du système immunitaire. Si linvasion bactérienne est très importante, cette réponse peut entrainer la mort de lorganisme infecté.

22 22 Les entérobactéries A lorigine le nom de la famille est lié au fait que ces bactéries ont été isolées du tube digestif des Mammifères. Cependant dans la famille des espèces sont pathogènes des plantes, mais leurs caractéristiques sont très voisines Caractéristiques générales Ce sont des bacilles à Gram négatif, mobiles au moyen de flagelles péritriches, ou non mobiles; aérobies facultatifs, ce qui veut dire quelles se développent mieux en présence quen absence doxygène. Elles produisent une ou des catalases mais donne une réponse négative au test oxydase. Elles peuvent utiliser les nitrates pour effectuer une respiration nitrate, mais sans convertir les nitrates ni en azote, ni en ammoniaque Elles produisent des acides à partir de glucose, même en présence doxygène. La fermentation du glucose se fait selon deux modes : la fermentation acides mixtes et la fermentation du butanediol. La plupart sont résistantes à la présence des sels biliaires qui sont présents dans leur habitat dorigine. Les genres principaux peuvent être séparés par des tests simples présentés dans la diapo suivante. Ce sont : -Enterobacter -Escherichia -Proteus -Erwinia -Hafnia -Citrobacter -Shigella -Salmonella -Edwardsiella -Serratia -Klebsiella Ces bactéries sont considérées comme des coliformes

23 23 RM+,VP- RM-, VP+ Proteus Klebsiella Serratia Enterobacter Escherischia Shigella Citrobacter Edwardsiella Salmonella uréase + uréase - Mobile, ODC- non mobile, ODC+ H2S+ H2S- gaz

24 24 Escherichia coli et les coliformes La bactérie bien évidemment la plus connue est Escherichia coli. Elle est présente dans le tube digestif de lHomme et des Mammifères, bien que ne représentant pas la flore dominante, (mais 80% de la flore aérobie), ce nest pas une espèce typiquement pathogène. Elle joue un rôle prépondérant dans le tube digestif parce quelle synthétise des vitamines (K), quelle absorbe très rapidement loxygène stabilisant les conditions danaérobiose nécessaire au fonctionnement de la partie basse du tube digestif (gros intestin). Les espèces sauvages nont pas dexigences nutritionnelles particulières, et utilisent une grande variété de substrats carbonés. Les coliformes Dans un grand nombre de cas, la recherche ou le dénombrement d Escherichia coli ou des coliformes fécaux est utilisé comme indicateur de contamination des eaux ou de certains produits. Ces bactéries : Escherichia, Citrobacter, Enterobacter et Klebsiella en grand nombre dans le tube digestif, survivent plus longtemps que les autres pathogènes, (jusquà 20 semaines). Ils sont donc un bon témoin de la contamination initiale des produits, de lhygiène de manipulation. De plus les techniques destinées à dénombrer ces germes sont performantes et faciles à utiliser. Il nest pas nécessaire didentifier formellement les souches pour conclure à la contamination puisque le plus souvent cest seulement à titre dindicateur que ce dénombrement est effectué. Sont définis comme coliformes totaux les bactéries qui à 30°C forment des colonies caractéristiques en gélose lactosée biliée au rouge neutre et cristal violet, lorsque lessai est pratiqué selon la méthode spécifiée. Norme ISO 4832 Et comme coliformes fécaux les bactéries qui à 44°C forment des colonies caractéristiques en gélose lactosée biliée au rouge neutre et cristal violet, lorsque lessai est pratiqué selon la méthode spécifiée. Norme NFV les colonies caractéristiques sont violacées dun diamètre de 0,5 mm ou plus parfois entourées dune zône rougeâtre due à la précipitation de la bile. Escherichia coli est déterminé par les réponses ++-- ou -+-- au test IMViC

25 25 Test IMViC I : pour production dindole à partir de tryptophane dans une eau peptonée exempte dindole (réactif de Kovacs, couleur rouge cerise quand positif) M : pour rouge de méthyle: lindicateur initialement rouge orangé, vire au rouge prononcé à laddition dans une aliquote de milieu de Clark et Lubs après 18 heures de culture, acidifié par les produits de la fermentation des acides mixtes, la réponse négative est indiquée par une couleur jaune du réactif Vi: pour Voges-Proskauer, apparition dune coloration rose, lors de laddition dans une aliquote de milieu de Clark et Lubs après 18 heures de culture, de créatine et/ou -naphtol en milieu basique bien oxygéné. La coloration correspond à la détection de lacétoine, cest-à-dire à la voie du butane–diol qui neutralise le milieu rendu acide par les acides mixtes C : pour citrate; les bactéries capables dutiliser le citrate du milieu, se développent dans un milieu où la seule source de carbone est le citrate de sodium. Le développement traduit la présence dune perméase au citrate.

26 26 Pathogènicité des Escherichia coli Bien que constituantes de la flore banale du tube digestif certaines souches peuvent être ou devenir virulentes, en particulier chez les personnes fragiles : jeunes enfants, personnes immunodéprimées naturellement ou non, personnes âgées. Elles peuvent alors occasionner des troubles intestinaux, diarrhées plus ou moins graves ce sont les E. coli entéropathogènes (EPEC) et entérotoxinogènes (ETEC) et des bactéries plus dangereuses les entérohémorragiques (EHEC) et entéro invasives (EIEC) : Parmi les souches les plus dangereuses : la souche O157, H7 est responsable de diarrhées hémorragiques. Voir facteur de virulence, adhésion et exotoxinesvirulenceadhésionexotoxines Cette souche représente un vrai problème aux USA: cas /an avant 2005, avec des épisodes infectieux très graves. A ce jour elle nest pas signalée comme posant des problèmes en Europe. En Auvergne moins de 10 cas ont été signalé les dernières années, ce qui ne veut pas dire que cela narrivera pas très rapidement dautant plus que les scientifiques ne savent pas pourquoi cette souche est restée surtout présente aux USA, malgré les échanges économiques de denrées alimentaires et de voyageurs potentiellement porteurs de germe. En 2005 : un foyer de 70 cas a été identifié dans le quart Sud –Ouest et depuis aucun épisode épidémique na été déclaré en France.

27 27 Salmonella Cest une bactérie habituellement mobile qui en général fermente le glucose avec production de gaz (hydrogène lyase), forme du SH 2 et nutilise ni le lactose, ni le saccharose. Toutes les souches sont pathogènes avec plus ou moins de virulence. Salmonella typhi et paratyphi sont responsables des fièvres typhoïde et paratyphoïde. La plupart des autres souches de salmonelles sont responsables de gastro-entérites 12 à 36 heures après ingestion daliments contaminés, traduites par des vomissements des diarrhées parfois sanglantes, des douleurs abdominales et des fièvres élevées. Ces symptômes disparaissent spontanément chez des individus en bonne santé mais peuvent entraîner la mort chez des malades fragiles. La dose minimale infectante est élevée : 10 5 à 10 6 germes mais dans certains cas quelques bactéries sont suffisantes pour provoquer une gastro-entérite : entre janvier et mai 2005, 140 nourrissons de moins de trois mois ont été infectés en région parisienne. 600 analyses ont été effectuées pour rechercher lorigine de la contamination, donc 420 prélèvement sur lenvironnement de la chaîne de production: seuls 6 prélèvement de lenvironnement ont détecté des salmonelles de la souche enterica impliquée dans lépidémie. Sur les boîtes non complètement consommées retrouvées (27) 270 analyses par fraction de 25 g ont permis de détecter la présence de salmonelles sur 4 boîtes pour lesquelles 1 ou 2 prélèvements par boîte étaient contaminés. Quelques salmonelles peuvent aussi entraîner des infections articulaires, des endocardites…. Les produits les plus souvent contaminés sont les volailles, les viandes, les œufs et ovoproduits La pathogénicité des salmonelles est voisine de celle des EIEC et ETEC. Elles peuvent se multiplier à lintérieur des cellules de la muqueuse intestinale et excréter des toxines qui passent par la voie sanguine. De plus les salmonelles possèdent des sytèsmes de destruction des FRO très performants (FRO formés par les macrophages) et ont donc la capacité à se multiplier dans les cellules de limmunité. Le LPS (endotoxine) st lui responsable du choc septique (lipide A).

28 28 Shigella Ce sont des bactéries proches du genre Escherichia. Elles peuvent occasionner des troubles intestinaux, diarrhées plus ou moins graves, avec la même stratégies que les E. coli entéro invasives (EIEC) : Parmi les souches les plus dangereuses : la souche O157, H7 est responsable de diarrhées hémorragiques. Voir facteur de virulence, adhésion et exotoxinesvirulenceadhésionexotoxines Cette souche représente un problème majeur dans les pays en voie de développement, là où les eaux sont insuffisamment traitées (camps de réfugiés, inondations…...). On compte environ 160 millions de cas par an avec une mortalité importante chez les petits enfants en Afrique Noire, Asie du Sud –Est et Amérique centrale avec une incidence annuelle de lordre de plus de 200 cas pour personnes par an. En France environ 1000 souches sont répertoriées par an par lInstitut Pasteur, dont la majorité provient de voyageurs rentrés de pays ou la shigellose est endémique. La prédominance est observée pour S. sonnei (58%) alors que pour lagent de la dysenterie: S. dysenteriae lincidence nest que de 3% sur les souches collectées. Leur pathogénicité est un mélange dentéroinvasion et entérotoxinogenèse, entrainant à la fois une diarrhée due à la destabilisation des membranes de cellules de lintestin, une invasion des tissus et une réponse inflammatoire violente. Une des toxines peut atteindre le système nerveux. Shigellose ou dysenterie bacillaire. La presse médicale Nicolas X.,Granier H. et P Le Guenn.

29 29 Les Vibrionacées Ce sont des bacilles droits ou courbes, mobiles au moyen de flagelles péritriches ou non mobiles, anaérobies facultatifs, produisant des acides à partir des sucres. Catalase positif et oxydase positif. Capables de pratiquer la respiration nitrate et de fermenter les sucres.. Cette famille compte quatre genres distingués sur leur besoin en NaCl pour leur croissance : Vibrio et Photobacterium ont besoin de sodium, moins de 100mM pour Vibrio plus de 100mM pour Photobacterium. Aeromonas et Plesiomonas nont pas dexigence en sodium Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus Vibrio cholerae et Vibrio parahaemolyticus sont deux espèces pathogènes pour lhomme, Leur habitat est en général les eaux même peu salines pour V. cholerae qui provoque de graves épidémies lors de lusage deaux non traitées. La contamination par V. cholerae se fait presque exclusivement par la consommation deaux peu ou pas désinfectée, alors que les gastroentérites à V. parahaemolyticus passent par la consommation de coquillages et crustacés provenant deaux contaminées. Vibrio cholerae adhére aux microvillosités de paroi intestinale au niveau de lintestin grêle, et se développe à la surface des cellules sans y pénétrer, et secrète des entérotoxines.

30 30 Les bactéries à Gram positif Staphylococcus à coagulase positive Streptococcus Bacillus cereus Clostridium perfringens et C. botulinum Listeria

31 31 Staphylococcus à coagulase positive ou S.aureus Les staphylocoques sont des coques immobiles anaérobies facultatifs, capables de réduire les nitrates en nitrites, à oxydase négatif, qui produisent des acides à partir de glucose : un peu dacétate et de CO2 en aérobiose de lacide lactique en anaérobiose. La plupart des souches tolèrent 10% de NaCl et se développent entre 18 et 40°C. Ils vivent en général sur la peau des animaux à sang chaud et dans les glandes de la peau, ainsi que sur les muqueuses. Quelques espèces sont pathogènes pour l homme et lanimal. Lespèce responsable de Toxi-Infection Alimentaire est Staphylococcus aureus. Lincidence des toxi-infections à Staphylococcus aureus semble en régression depuis Les malaises induits par Staphylococcus, sont spectaculaires mais ils durent peu de temps et sont rarement létaux sauf pour des nourrissons ou des personnes âgées affaiblies. Les symptômes apparaissent entre 1 et 8 heures après ingestion de laliment contaminé et se traduisent par des nausées, des maux de tête, des douleurs abdominales et des vomissements fréquents accompagnés de diarrhées. Il ny a pas obligatoirement de fièvre. Les personnes affectées ont la sensation impressionnante de mourir mais se rétablissent le plus souvent en 24 heures. Le risque le plus grave est celui de déshydratation. Quelques fois on préfère le terme dintoxination pour les pathologies liées à Staphylococcus. En effet cest lingestion dune quantité de toxine (0,1 à 10 µg) qui produit des troubles et non lingestion des bactéries. Cette quantité de toxine représente entre 5 x 10 5 et 5 x 10 6 germes par gramme de produit ingéré, indétectable, le métabolisme de Staphylococcus ne laisse ni goût ni odeur dans laliment. La bactérie peut cultiver de 6 à 46°C avec un optimum à 37°C ; la production de toxine se fait de 10 à 45°C avec un optimum à 40°C …..

32 32 Staphylococcus à coagulase positive ou S.aureus Les toxines : Deux coagulases: -une coagulase libre excrétée dans le milieu et qui provoque la prise en masse du sérum par transformation de fibrinogène en fibrine -une coagulase liée ou « clumping-factor » attachée à la paroi bactérienne et qui provoque lagglutination des bactéries entre elles. Ces deux coagulases protègent la bactérie de la destruction par le système immunitaire. Des hémolysines ou phospholipases excrétées qui déstabilisent les membranes des cellules de lhôte et provoquent la fuite des électrolytes Une entérotoxine thermostable (SE) et une toxine responsable du syndrôme de choc toxique(TSST). Quelques µg de lenterotoxine SE sont responsables, 4heures après consommation dun aliment, de vomissements et diarrhées. Il semblerait que les mastocytes (cellules du système immunitaire porteuse dIgE) libèrent au contact de SE des molécules dune part médiatrice de la réponse inflammatoire : histamine, sérotonine et dautre part mimétiques de neuropeptides, donc capables dactiver les spasmes de vomissement. TSSt altère la réponse immunitaire en élevant dans le sang la concentration de cytokines proinflammatoires (inducteur de fièvre via lhypothalamus). SE et TSST sont considérés comme des superantigènes qui activent la réponse immunitaire en se fixant directement sur une molécule du complexe majeur dhistocompatibilité, sans avoir besoin dêtre ingéré par les macrophages.

33 33 Streptococcus Ce sont des coques sphériques ou ovoïdes de moins de 2µm de diamètre, qui en milieu liquide sont associés par paires ou en chaînettes. La plupart sont anaérobies facultatifs mais certains préfèrent une atmosphère enrichie en CO 2, voire des conditions danaérobiose vraie. Ils nont pas de catalase. Leur métabolisme est fermentaire avec production principalement dacide lactique, mais pas de gaz, ce métabolisme est peu rentable, ils ont donc des exigences nutritionnelles complexes. Certaines souches fermentent les acides organiques et/ou les acides aminés.. Leur température optimale de croissance est autour de 37°C, ils font en général partie de la flore commensale, parasite ou pathogène de lhomme et des animaux y compris des insectes. Ils sont en général peu pathogènes mais sont recherchés chez les poissons, coquillages et crustacés à titre de témoins de contamination fécale récente. Streptococcus faecalis peut être responsable dinfections urinaires ou dendocardites

34 34 Bacillus Ce sont des bacilles droits qui peuvent mesurer entre 1,2 et 10 µm. ils sont mobiles, grâce à des flagelles péritriches. Ils sont aérobies ou anaérobies facultatifs. Ils produisent des spores centrales ou terminales, rarement déformantes. Loxygène est le principal accepteur final d électrons. Ils ont une réponse en général positive à la catalase et positive ou négative à loxydase. Ce genre comporte des espèces pathogènes : B. anthracis, le plus médiatisé, B. cereus, actuellement naturellement plus dangereux que B. anthracis, car responsables de toxi-infections alimentaires.( avec B. brevis, licheniformis, subtilis) B. thuringiensis est pathogène pour les insectes essentiellement mais peut lêtre aussi pour des mammifères : mastites bovines, Bacillus cereus Selon les souches il peut se développer de –1 à +59°C, ce qui en fait un germe ubiquiste, présent en général dans le sol. Son substrat de prédilection est le riz, dautant plus si des protéines animales sont ajoutées (jus de viande). Il se développe pour des pH allant de 4,5 à 9,3 et des Aw supérieures à 0,95 Les spores sont thermorésistantes : à 95°C; le temps de réduction au dixième de la concentration varie de 1 min à 5122 min pour les spores les plus résistantes. La pathogénicié est liée à la présence de toxines excrétées :

35 35 Bacillus Toxines de Bacillus cereus Tout comme Staphylococcus aureus, cette bactérie libère deux types de toxines, lune thermostable, lautre thermolabile Toxine émétisante ou cereulide : cest un peptide de 1,2 KDa thermostable (126°C pendant 90 min) et résistant à la protéolyse, elle est produite entre 20 et 30°C en fin de phase de croissance. Sa production est associée à la sporulation. Elle agit par intoxination. Son mécanisme daction est inconnu, elle provoque des vomissements, des crampes abdominales à partir dune ingestion de 400 à 500 µg. Toxine diarrhéigène : cest une protéines de D produite pendant la phase exponentielle de croissance. A une température de 18 à 43°C. La toxine est instable entre 4 et 25°C et détruite à 56°C pendant 5 min. Elle fonctionne comme une adénylate kinase qui provoque laccumulation de liquide et fuite des électrolytes : chlorure de sodium en particulier, dans lintestin par diminution du taux d ATP dans les cellules épithéliales. Cette toxine est rarement à lorigine dintoxination mais plutôt libérée dans lintestin lors de lingestion massive de B. cereus. (104 à105 germes /g) Les aliments responsables pour la forme diarrhéique sont les produits en sauce, éventuellement épicés, car les épices peuvent être porteurs de spores nombreuses ; pour la forme émétique, les aliments amylacés sont les principaux responsables. Les plats de riz dans les restaurants orientaux sont les principaux responsables des épisodes diarrhéiques liés à B. cereus. Pour que le riz ne colle pas et puisse être grillé, il est cuit mais nest pas refroidi en chambre froide qui agglutine les grains de riz. Cette pratique culinaire est particulièrement propice au développement de B. cereus. Clostridium

36 36 Clostridium perfringens, C. botulinum Ce sont des bacilles droits ou courbes qui peuvent atteindre 10µm de long, qui forment des endospores en général déformantes. Le plus souvent à catalase négatif, la plupart des espèces sont anaérobies bien que certaines soient aérotolérantes. Quelques espèces sont pathogènes pour lhomme et lanimal : Clostridium botulinum, perfingens, difficile, tetani. Les clostridies sont ubiquistes et trouvées dans le sol, les sédiments marins, les boues, les végétaux en décomposition, dans le tractus intestinal de lhomme et lanimal. Clostridium perfringens Cette bactérie mobile, est très anciennement connue pour provoquer ce quon appelait les gangrènes gazeuses. Linfection par cette bactérie commune dans le sol se faisait à loccasion du contact avec une plaie. Mais cette bactérie représente encore de nos jours un risque en agro-alimentaire. Lingestion de cette bactérie essentiellement présente sur les viandes de volailles et les viandes en général insuffisamment cuite, peut être suivie de la multiplication des bactéries dans les conditions danaérobiose du TD. Dans lintestin ces bactéries sporulent et cest au cours de la sporulation que les toxines sont libérées dans lenvironnement. Cette souche synthétise trois types dexotoxines : -lentérotoxine impliquée dans les TIAC, est une protéine qui sinsère dans la membrane de la muqueuse épithéliale lorganisme infecté et induit des perturbations des flux deau et de sels : Na+ et Ca++, ainsi que du glucose, -la toxine est une toxine nécrosante qui provoque la mort des cellules infectées, Ces deux toxines permettent donc à la bactérie en plus des effets diarrhéigènes, lentrée dans le système sanguin. -la toxine qui est une phospholipase ou lécithinase provoque une augmentation de la perméabilité des vaisseaux sanguins, la lyse des membranes cellulaires : leucocytes, hématies et des troubles de la coagulation et la toxine nécrosante pour les hématies. La dose infectante est d environ 10 8 cellules végétatives. Elle est souvent associée à la consommation de conserves familiales insuffisamment stérilisées.

37 37 Clostridium Clostridium botulinum Cette bactérie mobile est responsable de pathologies paralysantes (flasque) dues à laction dune neurotoxine qui bloque la transmission du signal nerveux. La maladie ou botulisme résulte de lingestion de neurotoxines ou de bactéries qui vont se développer dans lintestin et sécréter la toxine, ou encore de lintroduction au hasard de la contamination de plaies. Elle est souvent associée à la consommation de conserves familiales insuffisamment stérilisées ; Lespèce Clostridium botulinum correspond en fait à un groupe despèces produisant des neurotoxines, dont les spores peuvent résister à un chauffage allant jusquà 112°C. Les bactéries se développent à des pH supérieurs à 4,5 donc dans des aliments plutôt carnés peu acides. Les neurotoxines sont produites pendant la croissance sur des milieux complexes.

38 38 Listeria Ce sont de courts bacilles qui peuvent former des filaments de 6 à 20 µm dans les cultures âgées, ils ne forment pas de capsule et sont mobiles au moyen de flagelles péritriches en culture à 20-25°C. Les colonies sont bleues grises et ont des reflets bleus verts en lumière transmise oblique. La température optimale de croissance est entre 30 et 37°C. mais ils peuvent se développer de 1 à 45°C. Ils préfèrent les pH plutôt neutres ou alcalins de 6 à 9. Ils ne survivent pas 30 minutes à 60°C. Ils sont oxydase négatif. Le métabolisme du glucose conduit majoritairement à la production dacide lactique. ( sans gaz) Le test RM est positif et le VP aussi. Le citrate du milieu nest pas utilisé, lindole nest pas produit, lesculine est hydrolysée, mais pas lurée, ni la gélatine, ni la caséine. Listeria monocytogenes est pathogène pour lhomme et pour un grand nombre despèces animales. Facteur de virulence : Listeria synthétise une protéine dadhésion à la surface des cellules eucaryotes, qui induit la phagocytose par ces cellules. Une listériolysine se fixe sur le cholestérol des membranes cellulaires et lyse ces membranes ; une phospholipase complète léquipement dinvasion cellulaire. La listeriolysine formant des pores dans les membranes des hématies provoque lhémolyse. Tandis quune protéine ActA modifie la structure de lactine : support de tous les organites et mouvements cellulaires. Lentrée se fait par voie digestive, puis la bactérie sinternalise dans les macrophages qui en absence de réponse immunitaire forte vont saccumuler dans le foie et la rate sans détruire la bactérie. De là elle atteint tout le système sanguin et peut se localiser dans tout lorganisme. Les symptômes de listériose peuvent apparaître entre 4 jours et 4 semaines après lingestion. On estime que seulement 100 germes ingérés sont susceptibles dentraîner des troubles. Listeria provoque des septicémies, des encéphalites et lavortement des femmes enceintes vers le 5ème mois de grossesse. Les symptômes de listériose sont discrets : fièvre et état grippal, parfois maux de tête et raideur de la nuque, rarement troubles digestifs. Chez le nouveau-né la listériose provoque des méningites et encéphalites mortelles. Cest un germe ubiquiste que lon peut trouver aussi bien dans le sol, sur les légumes, les poissons, les viandes et charcuteries, les fromages.

39 39 Les germes daltération ou responsables de pathologies non alimentaires Les germes responsables daltération des aliments sont en général dégradent les qualités organoleptiques des produits, soit en produisant des biofilms visqueux, gras à reflets métalliques, soit par lémission de métabolites volatiles malodorants. Le développement de ces bactéries repousse la consommation des produits et même en absence de dangerosité réelle, ils sont recherchés parles services Qualité des entreprises alimentaires. Les germes pathogènes non responsables de TIAC peuvent être infiniment dangereux car le plus souvent indétectables. Des mesures dhygiène strictes ne permettent pas forcément déliminer leur présence. Les bactéries à Gram négatifs Borrelia (spirochète) Pseudomonadas Legionella Nesseria Les bactéries à Gram négatifs Bacillus Corynebacterium Propionibacterium Brochothrix

40 40 Les spirochètes (G-) Borrelia Ce sont dassez petits spirochètes de 3 à15 µm de long, anaérobies, dont la majorité des espèces sont des pathogènes pour lhomme et lanimal. Linfection provoque des fièvres récurrentes pouvant conduire à la mort de 40% des hôtes infectés si ceux-ci ne sont pas traités aux antibiotiques. La maladie la plus connue est la maladie de Lyme transmise par des piqûres de tiques en général ou de Taon entre un animal infecté et lHomme. Le symptôme le plus connu est la formation de rougeurs sous forme de disques qui sagrandissent, avec des douleurs diverses et de la fièvre. Cette maladie peut être mortelle après une attaque des tissus du cœur. Les premiers cas identifiés lont été aux Etats-Unis dans le Connecticut en 1975 et se répandent très largement, y compris en Europe. Actuellement : aux USA : cas par an, En Europe :de 5 (Irlande) à 350 (Autriche) pour habitants, 200 en France ; surtout Est et Centre (pas pourtour Méditerranée, ni montagne) flagelle Les spirochètes sont des bactéries ayant une morphologie très particulière et un mécanisme de mouvement également particulier. Ce sont des bacilles allongés, jusquà 500µm de long, ayant une forme spiralée. Ils sont mobiles grâce à des flagelles polaires rigides (de 2 à 100) qui sont insérés dans lespace périplasmique. Le cylindre protoplasmique est relativement rigide tandis que la membrane externe est souple. Leur mouvement est très rapide et flexueux.

41 41 Borrelia burgordferi Repas de sang Épiderme Animal infecté Lorsque la tique prend son repas de sang chez un animal Infecté, la bactérie migre dans le tube digestif du parasite. Quand le milieu sépuise en sang une protéine OspA est Exprimée, elle permet la fixation de Borrelia sur une protéine Réceptrice du tube digestif de la tique: TROSPA pour Tick receptor for OSpA OspA TROSPA La bactérie migre dans les glandes salivaires de la tique; la protéine OspC est alors exprimée et induit la secrétion par les glandes salivaires de la protéine Salp15, qui se fixe sur ospC Tick–host–pathogen interactions in Lyme borreliosis Joppe W.R. Hovius, Alje P. van Dam and Erol Fikrig Trends in parasitology, 2007 OspC Salp15

42 42 Borrelia burgordferi Épiderme Animal sain Lorsque la tique prend un repas de sang chez un animal non infecté, elle injecte dabord un anticoagulant produit par les glandes salivaires et en même temps la bactérie porteuse de OspC et Salp15. Salp15 est un inhibiteur de lactivation des lymphocytes T(immuno-supresseur) ; de plus Salp15 se fixe sur la protéine membranaire bactérienne OspC ce qui protège la bactérie de laction des anticorps de lhôte mammifère infecté. OspC Salp15 Y Épitopes: sites impliqués dans la reconnaissance Antigène-anticorps Antibodies against OspA epitopes of Borrelianext term burgdorferi cross-react with neural tissue Armin Alaedin.Journal of Neuroimmunology.2005 OspA Lymphocyte B A-C contre les tissus nerveux Cette bactérie est toxique par stimulation de la réponse immunitaire(lympho B) sans être elle-même atteinte, protégée par salp15. Certaines des protéines membranaires en particulier OspA ont des épitopes communs avec le tissu nerveux humain. Les anticorps dirigés contre OspA attaquent alors el système nerveux de lhôte infecté. Par ailleurs la bactérie se fixe sur les fibres de collagène provoquant des attaques articulaires. Lympho T

43 43 Pseudomonas (G-) Dans les viandes et dans le lait les bactéries dominantes à basse température : psychotrophes sont des Pseudomonas non pathogènes mais responsables de laltération des qualités organoleptiques du produit. Sur une viande réfrigérée ces souches peuvent représenter jusquà 75% de la flore totale. Leur développement forme une couche muqueuse à reflets verts fluorescents ou non. Ces bactéries en se développant libèrent des enzymes lytiques : protéases et lipases qui sattaquent à la paroi des cellules ou dans le cas du lait aux constituants du lait : caséines ou lipides. Le résultat est la dégradation des protéines en peptides et amines dont certains ont un goût et une odeur désagréable et dans le cas du lait une gélification même après traitement thermique (UHT) si le lait est trop chargé en Pseudomonas dont les enzymes protéolytiques sont thermorésistantes (quelques minutes à 140°C). Les lipides sont aussi dégradés, ce qui saccompagne dun goût de rance et dune déstabilisation de la crème. Brochothrix (G+) compléter

44 44 Legionella (G-) Ce sont de bacilles de petite taille <1µm, aérobies,qui ne possèdent pas de forme de résistance, ne sont pas encapsulés. Ils sont mobiles au moyen de 1 ou plusieurs flagelles polaires ou latéraux. Ils requièrent de la cystéine et des sels de fer pour leur croissance. Les sucres ne sont jamais utilisés ni comme source dénergie ni comme source dazote., elles préfèrent les acides aminés dans les deux exigences. La famille comporte une seule espèce : Legionella et 6 genres. Tous les genres sont potentiellement pathogènes pour lHomme. Legionella pneumophila Les tests oxydase et catalase sont positifs, le métabolisme respiratoire est exclusif, les nitrates ne sont pas réduits, le bacille produit des -lactamases, hydrolyse lhypurate et la gélatine. L.pneumophila est responsable de la maladie du légionnaire et de la fièvre de Pontiac. Ce sont des pneumonies sévères ayant 2 à 10 jours dincubation et véhiculées par lair. La mortalité peut atteindre 15% ou plus des personnes contaminées. Lhabitat original de ces bactéries est le sol ou leau douce, la contamination se fait chaque fois que de lair est humidifié, pulsé, entrainant des gouttelettes contaminées par le germe. L. pneumophila est un pathogène intracellulaire. La bactérie secrète une phospholipase qui lui permet de sagréger à la paroi des cellules épithéliales des alvéoles pulmonaires recouvertes de phospholipides, puis dhydrolyser ces phospholipides en lysophosphatidyl choline hautement toxique pour les cellules eucaryotes. La bactérie peut alors passer dans le système sanguin. Les macrophages internalisent la bactérie par phagocytose. La bactérie ensuite senveloppe dans une membrane qui se lie au lysosome, et se multiplie dans la vésicule ainsi créée. Elle synthétise une métalloprotéine de 39 kDa qui est cytotoxique pour les cellules eucaryotes, un petit peptide résistant à lacide et à la chaleur vient compléter le système de virulence. Ces deux protéines bloquent la réponse immunitaire des macrophages : arrêt du métabolisme oxydatif de ces cellules et action dune phosphatase qui inhibe la production de H 2 O 2, qui est en général une première étape de réponse des macrophages aux bactéries pathogènes internalisées

45 45 Neisseria (G-) Ce sont les rares coques essentiellement à Gram négatif, immobiles ayant un métabolisme oxydatif, à catalase positif qui nutilisent pas ou très peu les sucres. Le test oxydase est positif. Dans le genre Neisseria le seul à utiliser régulièrement les sucres, on rencontre des espèces très pathogènes Neisseria gonorrhoeae est lagent responsable dinfection des muqueuses, soit infections génitales communément appelée gonocoque, mais la même bactérie est responsable de conjonctivite, dinfection de lappareil respiratoire et même du sang et du liquide cérébro-spinal. Elle se présente sous forme de coques par paires. « grains de café » Neisseria meningitidis est lagent principal des méningites : ou inflammation des méninges, mais elle peut aussi causer les mêmes infections que la souche précédente dont elle est très proche phénotypiquement Ces bactéries ne produisent pas dentérotoxine, ni dexotoxine, elles ne sont pas non plus hémolytiques. Elles présentent par contre des structures de type adhésines ou fimbriae qui leur permettent dadhérer fortement aux cellules des organes colonisés. N. gonorrhoea et N. Meningitidis produisent une protéase très spécifique qui hydrolyse les immunoglobulines, et possèdent des mécanismes daccumulation du fer libre Les autres espèces de Neisseria sont responsables de pneumonies, dinfections urinaires, de septicémies. Ces bactéries sont ubiquistes mais en général non pathogènes, elles peuvent cependant être lagent de maladies nosocomiales chez des patients hospitalisés immunodéprimés, elles provoquent alors les mêmes maladies que les autres Neisseria.

46 46 Bacillus (G+) B. anthracis est présent dans le sol principalement, la forme sporulée est la forme la plus représentée dans les poussières. Les contaminations peuvent être respiratoires, gastrointestinales ou particulièrement dangereuses, lors du contact avec une plaie. Elle est très proche de Bacillus cereus. Les toxines de B. anthracis: trois exotoxines et une endotoxine Les exotoxines sont constituées de trois protéines qui selon leur assemblage forment une toxine oedémateuse ou une toxine léthale: EF pour edema factor, PA pour protective antigen et LF pour lethal factor L endotoxine est constituée par la capsule de poly acide g D-glutamique PA LF EF

47 47 Bacillus anthracis (G+) PA (735 AA) contient des régions impliquées dans la liaison à des récepteurs des cellules de lhôte infecté et permet la liaison et le transfert de EF et LF. PA sorganise en heptamères qui sinsèrent dans la membrane cytoplasmique des cellules de lhôte et forme des pores en forme de tonneau. Ces pores facilitent lentrée dans la cellule de EF et LF. De plus PA est un immunogène puissant. EF ou LF capillaire Récepteur sur les cellules eucaryotes PA PA X7 Cellule hôte

48 48 Bacillus anthracis (G+) EF (767AA) se lie à PA pour former la toxine oedèmateuse qui activate ladénylate cyclase et provoque laccumulation de lAMP cyclique dans nimporte quel type de cellule. Laccumulation dAMP cyclique induit la production dinterleukine par les lymphocytes, et inhibe la production du factor nécrotique des tumeurs ou TNF. EF inhibe aussi lémission de FRO par les polynucléaires neutrophiles. cellule hôte Adénylate cyclase lymphocyte T AMPc IL TNF EF neutrophiles FRO oedème

49 49 Bacillus anthracis (G+) LF (776 AA) se lie à PA pour former la toxine léthale, celle-ci nest active que sur les macrophages où elle stimule la production de FRO jusquà les lyser induisant une libération dinterleukine et de TNF qui causent un choc et la mort de lhôte. macrophage LF FRO IL, TNF Fièvre, Hyper puis hypotension Vasodilatation Fuite des électrolytes Oedèmes périphériques et intestinaux Hypercoaguabilité Diarrhée, vomissements

50 50 Bacillus anthracis (G+) L endotoxine est constituée par la capsule de poly acide g D- glutamique, capsule qui inhibe la phagocytose des bactéries par les macrophages (polynucléaires neutrophiles) et protège la bactérie dune part de la formation danti-corps puisque les macrophages ne peuvent lyser les cellules pour exposer les épitopes sur le CMH, dautre part de lélimination par ces mêmes macrophages et par les AC. Polynucléaire neutrophile

51 51 Bacillus thermoacidodurans ou coagulans (G+) B. Thermoacidodurans est responsables de surissement des conserves, présent dans les potages lyophilisés, dans les poudres qui servent à préparer ces potages. Ces bactéries ne sont pas pathogènes mais provoquent une altération des goûts des produits. En particulier dans les potages en poudre, lébullition ne détruit pas les spores, si le potage nest pas consommé dans son intégralité, il faut le placer impérativement au froid, et non le laisser refroidir à température ambiante, pour éviter la germination des spores

52 52 Bacilles (G+) non sporulés Corynebacterium : Ce sont des bacilles droits ou courbes, non mobiles. Aérobies à catalase positif Une partie des espèces est pathogène pour lhomme ou lanimal où éventuellement opportuniste. Les Corynebacterium de lhomme font en général partie de la flore des fosses nasales, dont certaines souches sont pathogènes comme Corynebacterium diphteriae ou C. pseudotuberculosis. Tandis quun autre groupe est pathogène des plantes du tabac à la pomme de terre en passant par le blé et le maïs. Propionibacterium Ce sont de petits bacilles pléomorphes, anaérobies à aérotolérants qui ont un métabolisme fermentaire avec production principalement dacides propionique et acétique, ainsi quun peu dacide iso-valérique, formique, succinique et lactique. Deux groupes de souches sont séparés : -les souches qui sont isolées des produits laitiers et fromages ainsi que des végétaux fermentant. On associe leur présence à la production de gruyère suisse et dEmmenthal à qui ils confèrent leur arôme caractéristique -les souches typiquement associées à la peau de lhomme : dont le principal représentant est Propionibacterium acnes. Il est présent dans les glandes sébacées et excrète des phospholipases, lécithinases et lipases qui dégradent les lipides de lépiderme en acides gras, eux-mêmes ayant un effet inflammatoire puissant. (boutons dacné)

53 53 Bacilles (G+) non sporulés Brochothrix Cette bactérie peut être isolée en courtes chaînes ou en filaments qui forment des amas. Bactéries non mobiles, dont la température optimale est 20-25°C, mais qui peut se développer entre 0 et 30°C, à pH voisin de la neutralité. En anaérobiose le métabolisme du glucose est majoritairement de lacide lactique et de léthanol. En aérobiose le métabolisme du glucose et spécialement en faible concentration conduit à la production dacides gras volatiles : isobutyrate et isovalérate. Brochothrix est la bactérie dominante isolée des viandes réfrigérées, particulièrement sur les viandes blanches prédécoupées et emballées dans des atmosphères appauvries en oxygène et enrichies en CO2. Le métabolisme de ces bactéries non pathogènes provoque des rejets important du produit à cause de lodeur nauséabonde qui se développe. Cest un germe quil convient donc de correctement maîtriser en industrie alimentaire et particulièrement dans le secteur des viandes..

54 54 Les bactéries des fermentations alimentaires Les saucissons, la choucroute, le vin et les boissons alcoolisées, les yaourts et les fromages, les olives, le chocolat…. sont les produits de transformation de matières premières par des microorganismes : bactéries, levures et moisissures. Seules les fermentations bactériennes seront traitées ici. bactéries à Gram négatif Famille des Acetobacteraceae bactéries à Gram positif Famille des Micrococcaceae Famille des Streptococaceae Les bactéries lactiques

55 55 Acetobacteraceae (G-) Acetobacter et Gluconobacter Ce sont des bactéries en général à Gram négatif, cependant, le Gram peut être variable. Elles sont mobiles et aérobies strictes, catalase positive, oxydase négative, elles ne forment pas de spores et ont un métabolisme strictement oxydatif, (pas de respiration nitrate). Elles tolèrent des pH bas et peuvent se développer à des pH inférieurs à 5. Elles réalisent une oxydation des alcools incomplètes jusquau stade acide acétique. Ces bactéries oxydent de plus un certain nombre dalcools en lacide ou la cétone correspondante. CH 3 CH 2 OH CH 3 CHO CH 3 COOH NAD + NADH O2O2 Génération ATP Plusieurs espèces dAcetobacter dont Acetobacter xylinum synthétisent une matrice de polysaccharides, cellulose, dextranes, lévanes, dans laquelle les bactéries sont emprisonnées. Le milieu reste limpide. Lintérêt pour ces bactéries est de construire une structure qui flotte et qui les situe à linterface entre le milieu peu oxygéné et lair. Certaines de ces bactéries ne sont pas capables de se développer dans un milieu agité, ce qui est le cas pour des bactéries du vinaigre.

56 56 Acetobacter xylinum Plusieurs espèces dAcetobacter dont Acetobacter xylinum synthétisent une matrice de polysaccharides, cellulose, dextranes, lévanes, dans laquelle les bactéries sont emprisonnées. Le milieu reste limpide. Lintérêt pour ces bactéries est de construire une structure qui flotte et qui les situe à linterface entre le milieu peu oxygéné et lair. Certaines de ces bactéries ne sont pas capables de se développer dans un milieu agité, ce qui est le cas pour des bactéries du vinaigre. vin Matrice de polysaccharides cellulose, dextranes, lévanes Vinaigre, technique dite « dOrléans » Générateur de vinaigre Lits arrosés vin Évacuation du vinaigre limpide

57 57 Acetobacter xylinum 2 De nos jours, dans les « Frings acetator » les bactéries sont mises en suspension dans un fermenteur de grande contenance ( entre 6000 et 8000L) par des microbulles doxygène injectées à la base du réacteur. Évacuation et filtration du vinaigre Vin ou …. Turbine et pales daération Wwww; patrimoine de France.org (nov 2009) Ce système permet lobtention de 3 000L de vinaigre par jour, à partir de vin, dalcool pur ou de cidre; la concentration en acide acétique atteint plus de 10% et celle d alcool reste inférieure à 0,3%. Les cuves utilisées sont en bois ou en acieret équipées de capteurs en continu.

58 58 Les bactéries lactiques (G+) et les bactéries acidifiantes Ces bactéries sont utilisées dans nombre de fermentations alimentaires: saucissson, fromages, yaourts, choucroute, vin….. Elles ont en commun de fermenter les sucres en acide lactique, que lacide lactique soit ou non le seul produit terminal du métabolisme. Différentes fabrications vont être décrites, avec à chaque fois le rôle des bactéries importantes dans le procédé de fabrication. Fabrication de saucisson Fabrication de produits laitiers: yaourts, fromages Production de choucroute Vinification

59 59 Production de yaourt Lactobacillus delbrueckii sous-espèce bulgaricus et Streptococcus thermophilus La production dacide lactique acidifie le milieu. Les points isoélectriques des caséines du lait sétalent de 4,1 à 4,9. Au Pi les protéines électriquement neutres sagglutinent, ce qui forme le coagulum typique du yaourt Le lactose est dabord hydrolysé en glucose et galactose par une galactosidase. Le galactose est transformé en glucose 1-P qui réintègre la glycolyse. Lactobacillus delbrueckii sous-espèce bulgaricus Est un Lactobacillus homofermentaire microaérophile qui fermente le lactose en acide lactique et qui possède une activité protéolytique conduisant à la libérationde peptides et acides aminés dans le lait à partir de la caséine. Ces acides aminés stimulent la croissance de Streptococcus Streptococcus thermophilus Est un streptocoque anaérobie qui ferment le lactose en lacide lactique mais avec aussi un peu dacide pyruvique et formique (et de CO 2 )utilisés par Lactobacillus. Ces deux bactéries forment un protosymbiose

60 60 Production de fromages: cas du Comté Lactobacillus delbrueckii sous-espèce lactis, Lactobacillus helveticus, Streptococcus thermophilus Propionibacterium freundenreichii Le lait est chauffé à 32° inoculé par lensemble des bactéries et après 1 heure additionné de présure (chymotrypsine de veau). Lorsque le caillé est formé il est cassé puis le mélange chauffé à 53°C pendant 45min. Thierry et al, 2004, Varied volatile compound are produced by Propionibacterium freudenreichii in Emmental Cheese Food Chemistry, 87, Incubation 1heure 3 2°C présure 53°C 45min 32°C

61 61 Production de fromages: cas du Comté 48°C; 36°C 20 heures fermentation acide lactique 11°C 21 jours sel « cuisson » pressage acide lactique acides acétique Propionique 67 composés arômatiques Propionibacterium Le caillé est ensuite égoutté puis pressé et mis à létuve à 48 puis 36°C. Cette étape (20 heures) permet une acidification de la pâte pressée. Cette pâte est ensuite refroidie et salée puis laissée à incuber à 11°C pendant au moins 21. Pendant cette période lacide lactique produit par les bactérie lactiques est métabolisé par Propionibacterium pour former majoritairement de lacide acétique et de lacide propionique parmi 67 composés arômatiques volatiles

62 62 Production de saucisson mêlée Composition type de mêlée Maigre de porc (10%lipides) 30 kg Trimming (25%lipides) 15 kg Poitrine (40% lipides) 20 kg Gras de porc 30 kg Sel 3 à 3,4 kg Saccharose et ou lactose et ou amidon 1,5 à 3,5 kg Na NO3 0,15 kg Épices 0,2 à 0,4 kg Carmin de cochenille 50 à 150 g Ferment [C] finale 10 6 à 10 7 /g Pour 100kg La mêlée, dont la composition figure à droite, est dabord hachée entre -3 et -4°C avec un hachoir dont les trous ont un diamètre de6mm

63 63 Production de saucisson Composition type de ferment Lactobacillus sake, plantarum, curvatus, pentosus Pediococcus acidilacticii, pentosaceusus Staphylococcus xylosus, carnosus (micrococcus varians, Kocuria varians) + Debaryomyces hansenii, Candida lipolytica, famata, mêlée Les bactéries sont inoculées dans la mêlée anaérobie mais avec un peu de nitrate (150 mg de NaNO 3 /kg) à raison denviron 10 4 germes par g, et lensemble est pétri au moins 3 minutes entre -3 et -4°C. La mêlée est ensuite « embossée » soit manuellement si le boyau est naturel (chaudin) soit automatique si le boyau est en collagène reconstitué, puis les saucissons sont attachés toujours entre -3 et -4°C

64 64 Production de saucisson2 La flore de surface est inoculée soit par trempage dans une suspension de spores de Penicillium nalgiovensis, chrysogenum, camemberti, puis les saucissons sont installés sur des bâtons. Linverse peut être effectué, cest- à-dire que les saucissons sont aspergés après suspension par les spores. Puis les saucissons sont mis en étuvage: 24 heures autour de 24°C ce qui permet de développement des bactéries inoculées, les saucissons sont ensuite refroidis par palier vers 12°C ou la maturation se fera. Les bactéries lactiques se développent rapidement, en 6 jours ils atteignent 10 8 /g, elles abaissent le pH vers 5,4 qui est voisin du pI des protéines de la viande, ce qui provoque la coagulation de la pâte. Elles hydrolysent peu les protéines. Lacidification rapide du milieu entraîne une réduction de la flore contaminante normale de la viande: entérobactéries et Pseudomonas. Les Staphylocoques réalisent une respiration nitrate laissant des nitrites qui en milieu réducteur se transforment en oxyde nitreux. Loxyde nitreux fixe la couleur de la myoglobine en rose. De plus les Staphylocoques (et les levures) hydrolysent les protéines et les lipides, ce qui contribue à lhomogénéité du produit et également à laromatisation par la libération de peptides et dacides gras. La présence de nitrite va inhiber le développement de Clostridium éventuellement présent. Les moisissures qui se développent après 5 à 7 jours, protègent le saucisson dune dessiccation trop rapide et contribuent à laromatisation.

65 65 Production de saucisson Etuvage de 24 à 48 heures à 24°C Temps en jours Nbre de germes/g (log) pH 5,6 5,4 5,2 levures Entérobactéries pH Bactéries lactiques staphylocoques Penicillium

66 66 Production de choucroute Lactobacillus plantarum, sakei, Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus pentosaceus, Lactococcus lactis Le chou est coupé en fines lames (1mm) additionné de 1% de NaCl et de ferment starter : 10 4 à 10 5 bactéries/g, puis incubé à 20°C pendant 4 à 14jours pour atteindre un pH inférieur à 4°C. Puis le mélange est refroidi à 4°C pour la conservation. Le développement des bactéries lactiques inhibe le développement des germes pathogènes qui peuvent être présents sur le chou cru: en particulier des entérobactéries et Listeria. Tolonen et al, 2004, Food Microbiology 21,

67 67 Vinification Le jus de raisin contient environ 100g de sucres/L : glucose, fructose et pentose( 1 à 5g), de lacide citrique(0,5g) et de lacide malique(4g), des levures, des bactéries lactiques et des bactéries acétiques. Les levures( Saccharomyces cerevisiae) se développent rapidement, faisant augmenter très rapidement le taux dalcool dans le jus fermenté. La teneur en alcool joue un rôle sélectif sur la flore lactique initialement présente. Leuconostoc oenos, Lactobacillus hilgardii et Pediococcus damnosus sont les espèces les plus résistantes à lalcool et qui vont rapidement dominer. Elles se développent dabord au détriment des sucres résiduels, environ1g, après larrêt de culture des levures qui sont inhibées par le taux dalcool, jusquà atteindre un niveau de 10 6 cellules par ml. Le produit principal de leur métabolisme est lacide lactique. A ce stade, entre 20 et 25 jours après le début de la fermentation le produit est riche en alcool et en acides. Le pH est voisin de 3. la fermentation malolactique prend alors place : lacide malique COOH-HCOH-CH2-COOH possède deux groupements carboxyliques acides. Les bactérie lactiques de cette étape peuvent décarboxyler lacide malique en acide lactique ce qui induit une remontée du pH denviron 0,3 unité. Lacide citrique présent en faible concentration peut également être métabolisé par les levures et des bactéries avec formation de molécules aromatisantes : la première étape est la formation dacétate et oxaloacétate décarboxylé en pyruvate. La voie butane diol conduit alors à partir du pyruvate à la formation de diacétyl, et acétoine Leuconostoc oenos, Lactobacillus hilgardii et Pediococcus damnosus

68 68 Vinification Leuconostoc oenos Lactobacillus hilgardii Pediococcus damnosus Fermentation malolactique

69 69 Les associations plantes- bactéries Racines de légumineuses Rhizobium Lassimilation de lazote atmosphérique se fait en anaérobiose au sein de symbiose entre des racines de légumineuses et des bactéries: Rhyzobium. Le mécanisme a été décrit dans le chapitre sur la nutrition des bactéries

70 70 Les associations plantes- bactéries Méristème sans bactérie Invasion bactérienne Zone de fixation de lazote Zone de sénescence poil absorbant Organisation des nodules Les bactéries forment sur les racines des nodosités dont lorganisation est complexe. Lentrée des bactéries se fait par les poils absorbants des fines racines. Les bactéries envahissent ensuite les tissus de la racine et y forment des colonies synbiotiques. La durée de fonctionnement de ces symbioses est limitée à trois semaines.

71 71 Les associations plantes- bactéries Les bactéries peuvent former des associations à bénéfices réciproques avec les racines des arbres ou des herbacées, sans que les bactéries colonisent les tissus de la plante mais seulement la rhyzosphère, cest-à-dire la sphère de captation de leau et des nutriments minéraux par le système racinaire, mais aussi la sphère dexcrétion de métabolites par les racines. Les bactéries constituent alors un moyen de protection des végétaux contre le dessèchement, et peuvent aussi accumuler les minéraux indispensables à la plante, pour les lui restituer progressivement. Ces associations sont assez générales. Les bactéries sont très diverses et varient selon le terrain, les végétaux, les climats….

72 72 Les bactéries pathogènes des végétaux et leur implication dans les OGM Les tumeurs végétales Les bactéries du genre Agrobacterium sont responsables de tumeurs végétales plus ou moins bénignes. Certaines sont envahissantes et les scientifiques ont étudié attentivement ces mécanismes, parce quils ressemblent au mécanisme de cancérisation chez les cellules animales. De manière générale pour se multiplier, les cellules végétales ont des besoins hormonaux qui régulent la croissance. Linfection par Agrobacterium libère les tissus végétaux de ces besoins, cest pourquoi les cellules prolifèrent sans contrôle hormonal. rosier vigne

73 73 Infection par les bactéries pathogènes Linfection Agrobacterium tumefasciens est responsable du Crown gall ou tumeur envahissante des plantes. Linfection dune plante par cette bactérie se fait à loccasion dune blessure. La reconnaissance entre la plante et la bactérie se fait par une interaction entre la pectine de la plante et le LPS de la bactérie. collet Ti T-DNA Lattachement de la bactérie à la plante se fait sans doute par la secrétion de microfibrilles de cellulose, qui ancrent la bactérie sur la plante. Les bactéries se multiplient alors à la surface de la plante en formant des colonies. Mais contrairement aux symbioses décrites précédemment les bactéries ne pénètrent pas à lintérieur des cellules de la plante, mais injectent de lADN dans les cellules de la racine. Ti Vir T-DNA Acc Con Ori

74 74 Infection par les bactéries pathogènes2 Le plasmide Ti Les bactéries portent un plasmideTi, pour Tumor Induction, denviron 200 kpb, dont une partie le T-DNA va sintégrer dans le génôme de la plante. Il porte également les gènes de catabolisme des opines Acc, les gènes qui induisent le transfert conjugatif dune bactérie à une autre Con, et les gènes de virulence Vir, cest à dire ceux qui vont induire le transfert du fragment T-DNA de moins de 25 kpb.. Ti Vir T-DNA Acc Con Ori T-DNA: gènes transfectés Ori: origine de réplication Con: gènes responsables de conjugaison entre bactéries Acc: gènes codant des enzymes de dégradation des opines Vir: gènes responsables du transfert aux cellules végétales

75 75 Infection par les bactéries pathogènes 3 Le T-DNA Le T-DNA code pour la synthèse de deux hormones végétales nécessaires à la multiplication des cellules : les auxines et les cytokines et aussi à la production dacides aminés modifiés, les opines Cest en fait le rapport entre ces deux types de molécules : auxine et cytokine; qui devient très différent de celui qui conduit à une croissance normale de la plante. Ces hormones stimulent la multiplication des cellules transfectées et donc la multiplication du fragment de gène responsable de la formation de la tumeur. La prolifération anarchique des tissus se fait donc ultérieurement sans lintervention de la bactérie Les opines sont des acides aminés spécifiques, qui servent de source de carbone et dazote, grâce à des enzymes codées par les gènes Acc pour favoriser la croissance d Agrobacterium. T-DNA Chromosome De la plante transfectée Cancérisation des tissus végétaux: Multiplication anarchique des cellules auxines cytokines opines

76 76 Le plasmide Ti et les OGM La capacité qua le plasmide à entrer dans une cellule végétale et à sintégrer au génome en fait un outil performant. Dans un premier temps les scientifiques ont modifié le plasmide Ti par mutations dans les gènes dinduction des tumeurs, pour éliminer la synthèse anarchique dhormones végétales. Ti Vir T-DNA ouvert Acc Con Ori Tmod-DNA opines Cytokines auxines Gène dintérêt inséré Après ouverture du plasmide des gènes dintérêt sont introduits, par exemple gènes de résistance à un herbicide spécifique.

77 77 Le plasmide Ti et les OGM Le gène sintègre au génome et la plante entière acquiert la résistance à lherbicide. Ce qui permet déliminer du champ les plantes indésirables en utilisant lherbicide choisi. En fait au départ les chercheurs se sont beaucoup excités sur la potentialité de transférer les gènes dassimilation de lazote dans les plantes, mais ce transfert sest vite avéré impossible, compte-tenu de la taille du génome à intégrer. Le plasmide Ti après quelques modifications est donc devenu loutil de base des producteurs dorganismes végétaux génétiquement modifiés. Ti Vir T-DNA Acc Con Ori Ti mod Vir Con Ori T-DNA modifié

78 78 Les bactéries probiotiques Pour quune bactérie soit considérée comme probiotique, il faut quelle soit dorigine humaine et quun certain nombre deffets bénéfiques à lhôte qui lhéberge ait été prouvé. Il faut dabord que les bactéries survivent au transit dans lestomac, à la présence de sels biliaires et simplantent dans le tube digestif. Les deux affirmations ont été prouvées, on sait par exemple que les bifidobactéries adhèrent fortement à la muqueuse intestinale. Réduction des risques de diarrhées et réduction des diarrhées installées Une étude chinoise de 2004 ( Zong et al) a comparé lefficacité des traitements usuels, cest-à-dire par un mélange de probiotiques: Lactobacillus bifidus (= Bifidobacterium), acidophilus et Enterococcus so, avec lefficacité du Smecta, pour réduire les diarrhées chroniques(plus de 12 mois). Ils ont conclu à une efficacité à peu près équivalente entre les deux traitements Stimulation du système immunitaireimmunitaire Parmi les effets bénéfiques sur la physiologie du TD, la présence de bactéries probiotiques, entre autres des bifidobactéries, provoque une stimulation de la maturation des entérocytes et une augmentation de leur turn-over, ainsi quune stimulation du système immunitaire via la sécrétion dimmunoglobulines dans la lumière intestinale Réduction de génotoxicitégénotoxicité La furazolidone est un antibiotique dusage courant mais qui présente un risque lorsquil saccumule dans les cellules: risque Cancérigène. Ce risque a été mis en évidence chez des poissons (Raipulis et al, 2005). Lincubation de cet ATB en présence de probiotiques réduit la réponse de stress chez des bactéries (E. coli). Ce qui signifie que la toxicité du produit est réduite par les probiotiques Amélioration de la digestion du lactose du taux de cholestérol sanguincholestérol Par la libération de galactosidase dans le tube digestif, les bactéries probiotiques étant capables de métaboliser le lactose Effet bénéfique sur lhôte

79 79 Les bactéries probiotiques2 Déconjuqaison des sels biliaires Les sels biliaires sont conjugués au niveau du foie, à de la glycine ou de la taurine avant dêtre stocké dans la vésicule biliaire. Ils sont ensuite libérés dans le contenu intestinal. Leur déconjugaison par les bactéries probiotiques, libère les sels biliaires qui retrouvent alors leur activité contre des bactéries pathogènes non commensales du tube digestif. Effet barrière Les bactéries probiotiques exerceraient également ce quon appelle un effet barrière contre les infections bactériennes par des pathogènes, en particulier chez des sujets affaiblis par des chimiothérapies ou antibiothérapies lourdes. Les hypothèses sur le mode daction sont dune part leffet de compétition pour les sites dadhésion et les substrats nutritifs, une stimulation de la motricité intestinale et dautre part la production dacides organiques (souvent acide lactique) actifs sur les bactéries non acidophiles. Lefficacité des probiotiques est associée également à la production de bactériocines : substances à capacité antibiotique et à la production de peroxyde dhydrogène. Des préparations à base de bifidobactéries sont dailleurs administrées aux prématurés et aux personnes âgées à mobilité réduite Réduction des métabolites carcinogènes Les bactéries probiotiques auraient également un effet antitumoral en particulier sur les cancers de la vessie (Takahashi et al 2001) peut-être par une inactivation ou une réduction des métabolites procarcinogènes présents dans le TD, soit à cause du métabolisme bactérien général, soit à cause de lalimentation. La sécrétion denzymes bactériens glucuronidases, azoréductase, nitroréductase, provenant de la flore normale du TD serait réduite par la présence de L. acidophilus. Ces enzymes transforment des molécules en amines carcinogènes, et leur synthèse serait réduite par des inhibitions liées au métabolisme par encore totalement éclaircies. Cette appellation « probiotique « est attribuée à un certain nombre de bactéries lactiques comme Lactobacillus casei, L. acidophilus, L delbrueckii, Bifidobacterium bifidus.

80 80 Les bactéries probiotiques 3 Bifidobacterium Ce sont des bactéries très pléomorphes, anaérobies mais dont certaines souches tolèrent loxygène. Ils dégradent les sucres en acétate et lactate (3/2). Ils font partie de la flore dominante du tube digestif dès les premiers jours de la vie. Si la flore totale est évaluée à par g de fèces, les bifidobactéries sont estimées à 10 9 entre 1 et 4 jours, cest à dire au même niveau que les entérobactéries. Cest la flore dominante pour les bébés allaités par la mère. Les bifidobactéries produisent de grandes quantités de vitamines et particulièrement les souches : B. breve, infantis et longum qui sont dominantes chez lenfant allaité par la mère, tandis que chez le nourrisson allaité au biberon, cest la souche B. adolescentis qui prédomine. B. breveB. infantisB. longumB. adolescentis Thiamine (B1) Riboflavine (B2) Pyridoxine (B6) Ac. Folique (B9) Cobalamine (B12) Ac ascorbique (C) Ac nicotinique (PP) Biotine (H)

81 81 Les bactéries probiotiques 4 Lactobacillus acidophilus Cest une bactérie commune du tractus digestif, productrice de peroxyde, cette souche est ajoutée dans certaines production de yaourt pour en changer la consistance et le goüt. Considérée comme probiotique, (avec L. casei) Cette bactérie adhère facilement aux cellules de lépithélium intestinal. Lefficacité des probiotiques, pour lutter contre la croissance des pathogènes responsables de TIAC, est associée à la production dacide lactique, à la production de bactériocines : substances à capacité antibiotique et à la production de peroxyde. Ces probiotiques sont également censés avoir un rôle daccélération du transit intestinal en particulier dans le cas de personnes à motricité réduite. Autres effets: Diminution du syndrome du colon irritable, Réduction des diarrhées associées à la prise dantibiotiques, Production de peroxyde dhydrogène par une NADH peroxydase. Lactobacillus acidophilus casei ou Lactobacillus GG Cest la souche qui adhère le mieux aux parois du tube digestif et aux muqueuses buccales. Elle colonise très fortement le TD et après consommation dans des produits laitiers fermentés on peut la retrouver au niveau de 10 6 par gramme de fèces. Elle a les mêmes effets que la souche L. acidophilus. Cest une souche ajoutée dans un certain nombre de boissons fermentées à base de lait recherchée pour ce qui est nommé leffet « santé ».

82 82 Les bactéries utilisées ou potentiellement utilisables en biotechnologie Lutilisation des bactéries est souvent méconnue ou sous estimée, et pourtant fait partie de notre quotidien. La liste des applications peut être très longue et seules quelques-unes seront exposées. -Synthèse de vitamine C, -Traitement de dépollution des eaux usées et des sols pollués, -Production de nanoparticules magnétiques, -Lutte biologique, -Production de biopolymères, -Compostage et méthanogénèse, -Production dhydrogène à usage de biocarburant………………………

83 83 Acetobacter Outre la production de vinaigre, lutilisation de ces bactéries est liée à la production de cellulose plus ou moins pure selon les souches dAcetobacter. Dans certains cas des polymères de xylane sont inclus dans la matrice. La souche sélectionnée est alors cultivée pour la production de biocellulose très pure et le polymère extrait puis purifié pour la fabrication de pansements à haute performance cicatrisante pour des ulcères par exemple. Il est possible dintégrer un antibiotique dans le film de biocellulose pour prévenir ou guérir les infections. Ces films de biocellulose sont également utilisés pour la fabrication de membrane de micros, en cosmétique, comme additifs alimentaires gélifiants ou pour la fabrication de papier. Bruckner et al, 2008, Conférence des plaies et cicatrisation

84 84 Synthèse de vitamine C : Gluconobacter oxydans Lobtention dacide ascorbique à partir de sorbose précurseur de la vitamine C, est chimiquement réalisable mais conduit à lobtention disomère D et L à 50 % chacun, donc peu rentable. Gluconobacter oxydans réalise loxydation stéréospécifique du D-sorbitol en L-sorbose. CH 2 OH HCOH HOCH HCOH CH 2 OH D-sorbitol CH 2 OH HCOH HOCH HCOH O=C CH 2 OH L-sorbose Gluconobacter oxydans Le D-sorbitol est obtenu par réduction électrolytique du D-glucose. Tandis que létape finale est une oxydation chimique du L-sorbose en L-ascorbate HCO HCOH HOCH HCOH CH 2 OH glucose Réduction électrolytique HCO HCOH HC COH C=O O L-ascorbate Oxydation chimique

85 85 Traitement de dépollution des eaux usées Le traitement des eaux usées implique un certain nombre détapes constantes, telles que le dégrillage, dégraissage…et des étapes variables selon le type de station dépuration utilisé. Au cours de votre carrière dingénieur vous pourrez être amené à piloter ou installer des stations dépurations, soit pour une entreprise qui traite ces eaux usées avant de les ajouter aux eaux domestiques, doit directement en pilotant une station dépuration municipale.

86 86 Traitement de dépollution des eaux usées 2 Le traitement des eaux usées implique un certain nombre détapes constantes, telles que le dégrillage, dégraissage…et des étapes variables selon le type de station dépuration utilisé. Au cours de votre carrière dingénieur vous pourrez être amené à piloter ou installer des stations dépurations, soit pour une entreprise qui traite ces eaux usées avant de les ajouter aux eaux domestiques, doit directement en pilotant une station dépuration municipale. clarificateur boues Recirculation partielle des boues recirculation Eaux usées. Leffluent est finalement déchargé dans le clarificateur où les boues se déposent, au besoin grâce à laddition de floculant, et les eaux claires de surface sont éliminées dans les cours deau. Si besoin une étape supplémentaire de percolation dans un sol végétalisé est ajouté. Les eaux passent ensuite dans un aérateur où lammoniaque sera en partie assimilé pour la synthèse dacides aminés et pour le reste convertie en nitrates par des bactéries nitrifiantes. Lépuisement des effluents en nitrates et ammoniaque au bénéfice de la libération dazote nécessite une recirculation dans les deux épurateurs anaérobie et aérobienitrifiantes. Les eaux usées peuvent dabord être traitées en anaérobiose. Pendant cette étape les nitrates qui arrivent dans les eaux sont convertis en NH4+ et N2, grâce à des bactéries qui réalisent la respiration des nitrates et soit vont jusquau stade azote moléculaire libéré dans latmosphère, soit jusquau stade ammoniaque dont une partie seulement sert à leur synthèse dacides aminés.

87 87 Traitement de dépollution des eaux usées 3 la nitrification Les bactéries lithotrophes tirent leur énergie de loxydation dun substrat minéral, cest le cas des bactéries nitrifiantes qui oxydent lion ammonium. Deux groupes bactériens le plus souvent autotrophes se succèdent pour cette opération, les bactéries qui vont jusquau stade nitrite puis celles qui vont au nitrate. Les deux étapes se réalisent à des pH alcalins, 7,5 à 8. Nitrosomonas, Nitrospira, Nitrosococcus, Nitrosolobus effectuent la première étape: NH /2 O 2 NO H + + H 2 O Nitrobacter, Nitrococcus effectuent la deuxième étape: NO2- + 1/2 O 2 NO 3 -

88 88 Biorémédiation La biorémédiation est lutilisation de stratégies diverses pour dépolluer des sols contaminés par des polluants en général des hydrocarbures. En règle générale les sols pollués contiennent des bactéries capables de dégrader ces polluants, mais souvent les conditions de développement des bactéries ne sont pas optimales voire pas viables. Leau nest pas disponible en même temps que le substrat hydrophile et le contact entre les bactéries et le polluant se fera mal ou pas. Leau peut être aussi peu abondante, sols trop secs Addition dans le sol de Tensioactifs Le substrat carboné est à saturation, mais les sources dazote et de phosphore sont limitantes voire absentes. Addition dans le sol de phosphate, dammonium durée ou de nitrates La dégradation des hydrocarbures passe par une oxydation en particulier quand des cycles phénoliques sont présents. Il faut aussi assurer lélimination du CO2 produit de la dégradation des hydrocarbures Ventilation du sol Circulation dair Arrosage du sol

89 89 Biorémédiation2 La biorémédiation peut se faire in situ ou après extraction des sols pollués ex-situ: Le bioventing consiste en laménagement dans le sol pollué de puits permettant la circulation de leau, linjection des nutriments et la circulation de lair. Les injections se font au centre de la zône polluée et les extractions en bordure de cette zône. Air Eau nutriments

90 90 Biorémédiation3 Lorsque le sol est pollué sur une faible profondeur, il est possible de lextraire et de le traiter dans un espace aménagé. Les résultats sont plus rapides. La terre polluée est déposée sur une surface étanche. Le tas de terre est arrosé avec de leau enrichie en tensio-actifs, phosphates, ammoniaque. Des conduites extraient lair enrichi en CO2 à partir du centre du tas et les liquides qui ont percolé dans la terre sont récupérés et en partie réutilisés. Eau, minéraux Extraction dair

91 91 Dégradation des hydrocarbures Atomes de O2, rarement séparés sauf pour former H20 Le plus souvent peroxydations Atomes de O2, séparés Agent doxydation Pas de fixation directe dO2 sur le substratIncorporation des atomes doxygène sur le substrat oxydase oxygénase AH 2 + O 2 + (2H + +2e - ) AHOH + H2O AH 2 + O 2 A(OH)2 La dégradation des hydrocarbures est rendue possible grâce à lactivité denzymes spécifiques aux Pseudomonas : les oxygénases. Ces enzymes attaquent directement les molécules à laide doxygène moléculaire. CH 2 CH 3 CH 2 CH 3 CH 2 hydrocarbure CH 2 CH 3 CH 2 CH 2 OH CH 2 + H 2 O alcool CH 2 CH 3 CH 2 COOH CH 2 Acide gras NADH, H + NAD + O2O2 oxydation déshydrogénation oxygénation

92 92 Dégradation des hydrocarbures cycliques Les performances de ce type de bactéries sont utilisées pour le traitement de nappe de pétrole. Un dispersant est vaporisé sur la nappe pour fractionner le film huileux. Le dispersant est Additionné de tensio-actifs, de bactéries et de source dazote et de phosphore O2O2 NADPH, H+ NADP COO - OH 4-hydroxybenzoate COO - OH + H 2 O 3,4- dihydroxybenzoate = protocatéchuate O2O2 COO - 3,4-carboxy-cis,cis-muconate

93 93 Production de nanoparticules magnétiques Les spirilles vivent en grand nombre dans les eaux et sont adaptés à la consommation de substrats organiques très divers et très dilués, ce qui leur confère un grand pouvoir délimination de la pollution en matières organiques des eaux. Une espèce présente un comportement très particulier puisquelle migre dans un champ magnétique en direction du Nord Aquaspirillum magnetotacticum. Elle accumule le fer sous forme de magnétite et se comporte comme de micro- aimants. Cest une bactérie microaérophile qui peut utiliser les nitrates mais aussi le fer III comme accepteur terminal des chaînes respiratoires. Oxydation dun substrat organique Récupération directe de - O 2 ou NO 3 Moins de 1% dO 2 Fe 3+ Fe 2+ anaérobiose Magnétosome magnétite Le fer participe à des échanges complexes : le Fe III entre dans la cellule où il est réduit contre loxydation dun substrat organique à disposition des cellules (pyruvate par ex) Le Fe II est ensuite réoxydé par loxygène présent en conditions micro-aérophiles, puis il sert comme accepteur respiratoire final. La magnétite est un mélange de Fer III et Fer II

94 94 Aquaspirillum magnetotacticum Nord Sédiments marins Trajet des bactéries La bactérie tant quelle possède des réserves de magnétite suit les courants magnétiques qui lui impose de senfoncer dans les eaux marines profondes donc anaérobies. En anaérobiose, le Fe II saccumule et le Fe III sépuise, et globalement le fer sépuise dans ces milieux carencés en fer. La magnétite apparaît donc comme une réserve de fer alternativement oxydé et réduit. Les magnétosomes qui ne seront alors plus efficaces et laisseront les bactéries remonter en surface, se recharger en zone aérobie en fer et donc en magnétite. Lorsque les bactéries meurent elles saccumulent dans les sédiments marins riches en magnétite. Champ électromagnétique terrestre

95 95 purification dune cible par magnétosome Extraction des granules de magnétites Encapsulation des magnétosomes dans des acides aminés Couplage entre un enzyme, ou un anti-corps et le magnétosome. Mélange bactérien A-C couplés Les japonais cultivent cette bactérie en milieu riche en fer et en conditions microaérophiles. Ils extraient les particules de magnétites qui sont couplées avec des acides aminés de manière à former une capsule magnétique sur laquelle sancrera lenzyme. On peut alors récupérer lenzyme après lavage des particules magnétiques. Fixation des bactéries cibles aux A-C Séparation des bactéries liées aux A-C par aimantation Elimination par rinçage de lindésirable

96 96 Lutte biologique B.thuringiensis Est lespèce type de bacilles pathogènes pour les insectes. Au cours du mécanisme de sporulation, il secrète une toxine protéique qui se condense sous forme dun cristal dans la cellule végétative. Lors de la lyse de la bactérie le cristal est libéré. Cette toxine ingérée par des insectes provoque des nécroses fatales de lappareil digestif des larves. Ce bacille a donc été envisagé comme agent de lutte bactériologique, soit sous forme de bactérie entière soit sous forme de dispersion du cristal toxique. Ce mode de lutte biologique serait particulièrement performant pour les régions où sévit la malaria véhiculée par les moustiques. La prototoxine une protéine de 130 kDa est solubilisée puis protéolysée en une toxine de kDa dans le tube digestif des insectes. La toxine se fixe alors sur un récepteur membranaire de la paroi intestinale et forme un pore de diffusion de leau et des électrolytes. La fuite de leau et des électrolytes provoque la mort des larves. Il semblerait de plus que la première voie daction de la toxine soit de bloquer les processus de nutrition de linsecte sans que ce mécanisme soit élucidé.. spore

97 97 Production de biopolymères Les plastiques traditionnels dérivés du pétrole ne sont pas biodégradables. Ils peuvent être remplacés partiellement dans certaines applications par des biopolymères qui sont biodégradables. Aujourdhui la plupart des biopolymères sont fabriqués à partir de produits dorigine végétale, mais les bactéries sont susceptibles de fabriquer des molécules polymérisables capables de remplacer en tout ou partie les polymères dérivés du pétrole. Alcaligenes latus (= Azohydromonas lata ) est une bactérie de la famille des Pseudomonas, donc aérobie stricte, qui synthétise un polymère: polyhydroxybutyrate qui lui sert de réserve énergétique et de carbone. Le polymère est synthétisé pendant la phase de croissance exponentielle puis laccumulation augmente quand le substrat est toujours disponible, mais le substrat azoté en carence. n O CH CH2 C CH3 O Le polymère pourrait avoir diverses applications: en médecine pour des fils de suture, dans le secteur agricole pour fabriquer des films biodégradables, dans le secteur domestique pour la production de sacs poubelles compostables, ou encore pour la fabrication dustensiles jetables pour la restauration rapide. Il est souvent nécessaire de mélanger des fibres végétales (cellulose) pour consolider le support plastique.

98 98 Compostage et méthanisation Les déchets végétaux, sauf exception sont biodégradables facilement. La pratique ancestrale de compostage sest modernisée avec la commercialisation de poudre de spores bactériennes: Bacillus subtilis et megaterium qui activent en germant et en se multipliant dans les déchets verts. Cette dégradation est accélérée par laddition de lombrics qui broutent les particules végétales, mélangent le compost et dont le tube digestif contient des bactéries cellulolytiques, xylanolytiques et chitinolytique (carapace des insectes). La méthanisation est une autre voie de valorisation des déchets organiques. Elle implique des conditions dincubation particulières. Elle comporte plusieurs étapes qui mettent en jeu des microorganismes organisés en « chaînes trophiques » et se réalise en anaérobiose stricte. Matière organique Protéines, Polysaccharides (cellulose, amidon) lipides La matière organique est dabord hydrolysée en composant simples: sucres, acides aminés acides gras par des enzymes excrétés par des bactéries hydrolytiques: Clostridium, Ruminococcus, Propionibacterium, Butyrivibrio Hydrolyse Composés simples Acides aminés Glucose, pentoses, Acides gras

99 99 Méthanisation Les composés simples sont fermentés par ces bactéries et des bactéries commensales (qui vivent avec) et transformés en acides organiques et alcools; eux-mêmes dégradés en acide acétique, hydrogène et CO2 par des bactéries acétogènes. Composés simples Acides aminés Glucose, pentoses, Acides gras Fermentation Ac. lactique, propionique, éthanol, glycérol Acétogénèse Ac. acétique, CO2, H2 Les bactéries méthanogènes sont soit acétoclastes, cest-à-dire qui clivent lacide acétique en méthane et CO2, soit autotrophes et hydrogènophiles: elles forment du méthane par réduction du CO2 en conditions danaérobiose stricte. CH4 Méthanogénèse acétoclaste Méthanogénèse autotrophe Le mélange gazeux obtenu ou biogaz est composé en moyenne de 50 à 80% de méthane; le reste des gaz étant du CO2 et de lazote gazeux

100 100 Production dhydrogène Dans loptique de remplacer les sources dénergies fossiles par des carburants renouvelables lutilisation dhydrogène est envisagée. Lhydrogène peut être produit par des voies chimiques mais aussi par un procédé proche de celui de la méthanisation. Des consortia bactériens dégradent des déchets végétaux pour produire de lhydrogène. Le point critique de ce procédé est déviter la production de méthane, en particulier en sélectionnant des consortia dépourvus de bactéries méthanogènes, et en régulant le pH à une valeur basse. Lautre difficulté de ce procédé est laccumulation dacides organiques courtes chaîne: acétique, butyrique,propionique qui sont des polluants et qui devront être valorisés à leur tour. La production dhydrogène peut être aussi le produit de la photosynthèse par des bactéries sui utilisent des acides gras comme source de carbone et la lumière comme source dénergie en libérant de lhydrogène: par exemple Rhodobacter Le point critique est alors la diffusion de la lumière dans le milieu de culture ou la concentration bactérienne est élevée.

101 101 NO 3 - NAP cytC NORC N2ON2O N 2 ORP N2N2 NO 3 - ABC transporteur Nitrate réductase assimilatrice 3 3 Nitrate réductase dissimilatrice 1 1 NAS NiRP NO NO 2 - Nitrate réductase respiratoire 2 2 NO 2 - NAR NH 4 + Nitrite réductase assimilatrice Dénitrification

102 102 e-e-e-e- cytoplasme espacepériplasmique cytc 2 H+ 2 H+ NO 3 - +H2O NO QH 2 Q 2 H+ cytc MoPt MoPt Fe -S NapB NapCNapA 1 1 Dissimilation nitrate : Nap 1

103 e-e-e-e- cytoplasme espacepériplasmique 2 H+ ATPsynthase MoPt MoPt 2 H+ 2 H+ NO H2O NO QH 2 Q 2 H+ cytb Fe -S NarlNarH NarG NarK ATPADP 22 Respiration nitrate : Nar 2

104 104 e-e-e-e- cytoplasme espacepériplasmique 2 H+ 2 H+ NO H2O NO 2 - +FAD Fe -S MoPt MoPt Fe -S NasCNasB NasAATPADP NH 4 + NAD(P)H 33 Assimilation nitrate : Nas 3 ABC transporteur NO 3 - +

105 105 Réduction de génotoxicité génotoxicité Lb acidophilus Streptococcus thermophilus Bifidobacterium lactis Lactobacillus plantarum Lactobacillus casei %tage dinhibition de génotoxicité de la furazolidone sur E.coli (réponse de type SOS)

106 106 Japon 2005 Stimulation du système immunitaireimmunitaire Probiotiques incorporés à lalimentde truites à raison de bactéries viables par gramme daliment Jour OJour 1OJour 2O témoin Lactobacillus rhamnosus Concentration en immunoglobulines (mg/ml)

107 107 S1 S Taïwan 2005 Réduction du taux de cholestérol sanguincholestérol Souris alimentées avec un régime riche en cholestérol et une boisson additionnée de probiotiques LDL Cholestérol total Taux de cholestérol eau Lait + Lb casei Lait + Lb plantarum Lait + Lb acidophilus


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