1er symposium thermal européen Sophie Pécastaings 11 novembre 2006 1er Symposium Thermal Européen Optimisation de la lutte contre les Légionelles et autres micro-organismes opportunistes des réseaux d’eau minérale naturelle Je me présente … Je vais vous présenter ici les premiers résultats de l’étude intitulée « Optimisation de la lutte contre les Legionella et autres opportunistes des réseaux d’eau minérale naturelle ». Ces travaux ont été effectué à l’Institut du Thermalisme, Université Bordeaux 2. Sophie Pécastaings

1er symposium thermal européen 11 novembre 2006 Introduction Durcissement des réglementations concernant la qualité de l’eau Conception d’un pilote eau thermale Objectifs Étude de la contamination naturelle du pilote Étude de l’efficacité de 2 méthodes de désinfection Ces dernières années, on a observé le durcissement des réglementations concernant la qualité de l’eau, notamment de l’eau thermale. La réglementation du 19 juin 2000, relative à la gestion du risque microbien dans les établissements thermaux, préconise, en France, de ne détecter aucun micro-organisme pathogène ou de contamination fécale dans l’eau minérale naturelle. Cette réglementation difficilement applicable, notamment de par le caractère naturel de l’eau minérale. Dans le but de valider les techniques de désinfection préconisées par la réglementation du 19 juin 2000, l’Institut du Thermalisme a conçu un réseau pilote eau thermal, qui vous a précédemment été décrit par ma collègue. Nous avons tenté de répondre à deux questions en effectuant des recherches grâce au pilote eau thermale. Comment le pilote se contamine-t-il en l’absence de tout épisode de désinfection ? Quels sont les effets de 2 méthodes de désinfection sur pilote contaminé ? 17 novembre 2006 Aix-les-Bains

Matériel et méthodes (1) 1er symposium thermal européen 11 novembre 2006 Matériel et méthodes (1) Inoculation du pilote Pseudomonas aeruginosa Isolée dans le pilote eau thermale 1011 UFC inoculés au pilote eau thermale Je vais vous présenter en premier lieu le matériel utilisé pour cette étude. Pour tester les différentes techniques de désinfection, nous avons contaminé artificiellement le pilote eau thermale. Nous avons utilisé la bactérie Pseudomonas aeruginosa. Il s’agit d’une bactérie ubiquiste souvent retrouvée dans les milieux humides donc dans les réseaux d'eau. Elle représente un risque en tant que pathogène opportuniste. Référence : Stover et al. 2000 (Complete genome sequence of P.a. PAO1, an opportunistic pathogen). La souche utilisée a été retrouvée naturellement dans le pilote eau thermale, et donc déjà habituée à un environnement oligotrophe. L'inculum bactérien a été préparé dans un milieu R2A liquide, milieu pauvre en nutriments. L'inoculum, constitué de 10^11 UFC de P. aeruginosa, a été versé au niveau du ballon du pilote eau thermale rempli de 400 litres d'eau minérale naturelle. L'eau contaminée a ensuite été mise en circulation dans le réseau pendant 1h20. 17 novembre 2006 Aix-les-Bains

Matériel et méthodes (2) 1er symposium thermal européen 11 novembre 2006 Matériel et méthodes (2) Pilote eau thermale EGOUT BALLON CANALISATIONS TESTS ERA EMN BRAS MORT ECHANGEURS Le pilote eau thermale que nous avons utilisé est représenté par le synoptique suivant, qui vous a déjà été décrit par ma collègue. Les inoculations bactériennes se font au niveau du ballon d’eau. Onze points de prélèvements ont été disposés en amont et en aval des éléments du réseau : après le ballon, avant et après la pompe, avant et après les échangeurs, avant et après les canalisations à tester. POMPE 38°C 28°C 17 novembre 2006 Aix-les-Bains

Matériel et méthodes (3) 1er symposium thermal européen 11 novembre 2006 Matériel et méthodes (3) Analyses de l’eau Flore hétérotrophe revivifiable à 37 et 22°C Témoins de contamination fécale Pseudomonas aeruginosa Legionella sp. dont L. pneumophila L’eau minérale naturelle du réseau a été prélevée stérilement aux onze points de prélèvement. Les analyses ont été effectuées selon les méthodes normalisées par AFNOR. Nous avons déterminé : La flore revivifiable en suspension dans l’eau minérale naturelle (description dans la norme AFNOR NF EN ISO 6222). Recherche et dénombrement des témoins de contamination fécale (méthode par filtration de l’échantillon) dont les Coliformes (E. coli), les Entérocoques et les spores de bactéries anaérobies sulfito-réductrices (Clostridia). Nous avons également recherché P. aeruginosa. Et Legionella sp. dont Legionella pneumophila. 17 novembre 2006 Aix-les-Bains

Matériel et méthodes (4) 1er symposium thermal européen 11 novembre 2006 Matériel et méthodes (4) Techniques de désinfection Choc thermique Choc chimique (PHMB) Eau de ville Dilué dans l’eau de ville 80°C Concentration = 25mg/L 1h 1h15 Nous avons testé deux méthodes de désinfection : La désinfection thermique : de l’eau de ville est chauffée dans le ballon à l’entrée du réseau pilote. Lorsque la température a atteint 80°C, l’eau est mise en circulation, en circuit fermé pendant 1 h. Désinfection par le PHMB (ou polyhexaméthylène bigunide). Le produit pur est dilué dans de l’eau de ville au niveau du ballon du pilote, afin d’atteindre une concentration de 25mg/L. La solution désinfectante est mise en circulation, en circuit fermé dans le pilote pendant 1h15 environ. Chaque épisode de désinfection se termine par une vidange et un rinçage du réseau au moyen d’eau minérale naturelle de Dax, afin d’éliminer toute trace de produit désinfectant. 17 novembre 2006 Aix-les-Bains

1er symposium thermal européen 11 novembre 2006 Résultats (1) Contamination naturelle (1) UFC/mL 37°C 22°C Lors de cette étude, on est parti d’un pilote décontaminé (au jour 0 sur le graphique), puis on l’a utilisé quotidiennement pour mimer le fonctionnement d’un établissement thermal. On a ensuite observé l’évolution des concentrations en flore hétérotrophe revivifiable dans le pilote en fonction du temps, représenté dans le graphique suivant. En abscisse, se trouve le temps en nombre de jours après la désinfection (le jour 0 représentant le jour de la désinfection). Les concentrations sont exprimées en UFC/mL. En blanc sont représentées les concentrations en flore revivifiable à 37°C, et en bleu, les concentrations en flore revivifiable à 22°C. Les histogrammes représentent les concentrations moyennes en flore revivifiable dans le pilote, effectuées sur 11 essais (représentant les 11 onze prélèvements). On remarque en fait que les concentrations en flores revivifiables augmentent (jusqu’au jour 10 pour la flore à 22°C et jusqu’au jour 18 pour la flore revivifiable à 37°C). On observe ensuite une diminution des concentrations. Du jour 18 au jour 24, la flore revivifiable à passe de 1000UFC/mL à 100UFC/mL. La contamination n’est donc pas homogène dans le temps. jours 17 novembre 2006 Aix-les-Bains

1er symposium thermal européen 11 novembre 2006 Résultats (2) UFC/mL Contamination naturelle (2) 37°C 22°C Toujours dans le cadres de l’étude de la contamination naturelle du pilote, nous avons cherché à déterminer s’il existait une différence de contamination au niveau des différentes parties du pilote. Ici, le graphique représente la concentration en flore revivifiable dans le pilote (axe des ordonnées) en fonction de l’endroit où l’on se trouve dans le pilote, donc du point de prélèvement (abscisses = points de prélèvement). Le but étant ici de savoir si la contamination bactérienne est différente dans les différentes partie du pilote. En fonction des différentes parties du pilote, la contamination n’est pas la même. On voit une augmentation pour la flore revivifiable à 37°C. 17 novembre 2006 Points de prélèvement Aix-les-Bains

1er symposium thermal européen 11 novembre 2006 Résultats (3) 37°C 22°C Efficacité du choc thermique Contamination naturelle Contamination artificielle UFC/mL 97% * 58% * Après avoir examiné la contamination naturelle du pilote, nous avons testé 2 méthodes de désinfection. Cette diapositive représente les résultats des tests du choc thermique. Deux tests ont été effectués, sur pilote contaminé naturellement (graphique gauche) et sur pilote contaminé artificiellement (graphique de droite). Les graphiques montrent l’évolution des concentrations en flore revivifiable dans le pilote, en fonction du temps représenté en abscisses. Les flèches verticales représentent la désinfection par choc thermique à 80°C. On remarque que la désinfection par choc thermique est plus efficace sur pilote contaminé naturellement (97% des bactéries planctoniques sont éliminées), mais beaucoup moins efficace sur pilote contaminé artificiellement (58% seulement des bactéries sont éliminées). Les astérisques au dessus des histogrammes représentent la présence de Pseudomonas aeruginosa dans le pilote eau thermale. On constate que P.aeruginosa n’est pas détecté dans le pilote eau thermale immédiatement après la désinfection par choc thermique. Cependant, 7 jours après la désinfection, P.a. est de nouveau détecté au niveau de 4 points de prélèvements à des concentrations supérieures à 100UFC/mL : la recontamination par Pseudomonas aeruginosa est donc très rapide. 1 1 7 jours 17 novembre 2006 Aix-les-Bains

1er symposium thermal européen 11 novembre 2006 Résultats (4) Efficacité du choc chimique par PHMB * 37°C 22°C * UFC/mL Cette diapositive représente les résultats de la désinfection par choc chimique par PHMB. Cette fois le test a été réalisé uniquement sur pilote contaminé. Ici, le graphique représente la variation de la concentration moyenne en flore revivifiable dans le pilote (moyenne au 11 onze point de prélèvement) en fonction du temps (axe des ordonnées), avant et après la désinfection par choc chimique par le PHMB. La flèche verticale indique l’épisode de désinfection. Ici, l’efficacité est de 100% pratiquement, puisque après la désinfection, on ne détecte pratiquement aucune bactérie dans le pilote. Cependant la recontamination est très rapide : 5 jours après la décontamination, des P. aeruginosa est détecté au niveau de 3 points de prélèvement (de 8 à 38 UFC/mL). 17 novembre 2006 Aix-les-Bains jours

1er symposium thermal européen 11 novembre 2006 Conclusion Pilote = modèle répondant à nos attentes Méthodes de désinfection à améliorer Espèce étudiée de Legionella pneumophila Les premiers résultats de l’étude montrent que le pilote eau thermal est un modèle utile pour effectuer des recherches concernant le maintien de la bonne qualité de l’eau thermale. Ces résultats montrent aussi que les techniques de désinfection appliquées pourraient être améliorées notamment dans le but de diminuer le temps de recontamination du réseau. La suite des études va à présent s’orienter sur la bactérie Legionella pneumophila, espèce plus problématique au niveau des réseaux d’eaux minérales naturelles. 17 novembre 2006 Aix-les-Bains