Resuscitation of Vibrio vulnificus from the Viable but Nonculturable Stat American Society for Microbiology 1991 LENA NILSSON,JAMES D. OLIVER,AND STAFFAN KJELLEBERG University of Goteborg et University of North Carolina HACHOUMI Imane

Sommaire Introduction Matériel et Méthodes Résultats Discussion Conclusion

Vivant ≈ Viable = Capacité à former une colonie Métaboliser Grandir Se diviser → 3 Notions Fondamentales associées à la Cultivabilité :

Et lorsqu’elles perdent cette capacité, elles sont alors usuellement considérées comme mortes.

Viable mais Non Cultivable = Un état physiologique une réponse de survie des bactéries exposées à des conditions de stress environnementaux (tels qu’une température très basse). Une cellule bactérienne ne peut pas être cultivée via les milieux de culture conventionnels Métabolisme active lorsque les conditions seront à nouveau favorables Les bactéries peuvent revenir à l’état normal

la «resuscitation» Cellule en état VBNC si les conditions capable de redevenir cultivable si les conditions Environnementales s’améliorent la «resuscitation»

Vibrio vulnificus Habitat : - Gram négatif, Mobiles grâce à un flagelle polaire entouré d'une gaine , - Halophiles, anaérobies, non sporulés. Vibrio vulnificus est présent dans l'environnement marin (notamment dans les estuaires).

Conditions d'entrée en état VNC: carence en nutriments, T= 5°C Conditions de resuscitation: eau de mer artificielle avec augmentation de température

MATERIEL ET METHODES

Les flacons placés à 5°C 1) Organisme et conditions de microcosme N0 ( dans les microcosmes) = 2,0 x 106 UFC / mL. Les flacons placés à 5°C Une souche de V. vulnificus VNSS bouillon, à T°C ambiante avec agitation

2) Énumération des cellules et des mesures de viabilité. la numérotation totale sur plaque: plaque de gélose LB 20 (gélose nutritive), (effectuée au microscope) Cette technique ne permet pas de distinguer entre les cellules vivantes et cellules mortes. coloration à l’Acridine Orange (AODC): énumérations par coloration. L’acridine orange; fluorochrome qui se fixe sur les acides nucléiques de toutes les bactéries permettant de les colorer en vue de les dénombrer.

cristaux de formazan(INTF), la méthode INT :est fondée sur l'utilisation d'un cristaux de formazan(INTF), de couleur rouge réduit par les cellules vivantes sel de tétrazolium incolore (INT) Cette Transformation reflète traverse les parois cellulaires et intervient comme accepteur d'électrons l'activité respiratoire des cellules. comme une indication de la viabilité du microorganisme

Conditions de la resuscitation Eau de mer artificielle avec augmentation de température Observations microscopiques  Les effets de chloramphenicol et ampicillin sur la resuscitation  : Sont des antibiotiques

Résultats

Resuscitation des cellules viables mais non cultivables: changement de l’activité AODC INT Plate count de la T°C 27 J

Explication de la courbe Dénombrement sur plaque (Plate count)a indiqué que l’incubation à basses températures à 5°C a entrainé la non cultivabilité dans environ 27 jours. Par contre, les autres techniques (INT et AODC) montrent qu’il y a une importante population de cellules actives (vivantes) D’où les chercheurs ont conclus que ces cellules sont viables mais non cultivables . Ainsi on a resuscité les cellules a température 23°C,et on a remarqué qu’au bout de 3 jours ,elles ont atteint le même niveau que les cellules d’origine.

La capacité a répondre à plusieurs cycles de resuscitation Dans le but de déterminer si les cellules sont capables de répondre à plus d'un cycle de température ;les cellules ont été exposées alternativement à 5°C et à la température ambiante (23°C).

La figure montre que les cellules qui sont non cultivables, lorsqu’on applique une température ambiante de 23°C,elles répondent très pdt au moins 4 jours et reviennent à leur état d’initial. Ces cellules pourraient à nouveau être réanimé par incubation à température ambiante

changements de la morphologie Bâtonnet 0,8µm Cocci Le passage à l’état de VBNC s’accompagne de certaines modifications morphologiques.

Effets de l'exposition à l'ampicilline et le chloramphénicol Tot C No antibio Pla C 25 h 72 h 75 h

l'ampicilline= inhibiteur de la synthèse des protéine Chloramphénicol= inhibiteur de la synthèse de peptidoglycane Courbe A; Témoin Courbe B: la resuscitation cellulaire a été clairement interrompue= car les inhibiteurs ont été ajoutés après 24 h de la résuscitation à T° ambiante Courbe C et D: Légère inhibition sur la resuscitation cellulaire= car les inhibiteurs ont été ajoutés après 72 h de la résuscitation à T° ambiante

La différences entre les 2 techniques ; Total count et Plate count Aplatir sur des boites pétrie Observation par microscope Total count =ne permet pas de distinguer entre cellule viables et mortes . Par contre Plate count ne permet que le dénombrement des cellules vivantes

Discussion

Resuscitation des cellules viables mais non cultivables V. vulnificus entre dans un état viable mais non cultivables après une incubation à 5°C dans des microcosmes ASW, il a fallu environ 27 jours pour que les cellules deviennent non cultivables. La capacité a répondre à plusieurs cycles de resuscitation la bactérie V. vulnificus qui entre en VNC avec des températures faibles, peut en sortir simplement par augmentation de la température de culture. Les cellules ont pu passer au moins deux cycles de non cultivabilité et la resuscitation ultérieure sans changement du nombre cellulaire total

changements de la morphologie La morphologie cellulaires: après 48 h d'incubation à température ambiante. Le volume cellulaire augmenté quatre fois à la suite de l'absorption d'eau par les cellules. Après 96 h à température ambiante, la taille des cellules diminués en raison de la division réductrice, avec une diminution de la biomasse.

Légère inhibition sur la resuscitation cellulaire Effets de l'exposition à l'ampicilline et le chloramphénicol chloramphénicol et de l'ampicilline + cellules resuscitées après 72h Légère inhibition sur la resuscitation cellulaire Car la protéine active et la synthèse du peptidoglycane étaient en cours pendant toutes les étapes de la resuscitation.

la resuscitation cellulaire a été clairement interrompue chloramphénicol et de l'ampicilline + cellules resuscitées après 25h la resuscitation cellulaire a été clairement interrompue Car une fraction seulement de la population était encore dépendante des protéines et la synthèse du peptidoglycane .

La lyse des cellules n'a pas été induite par les inhibiteurs La numération cellulaire totale est restée cte tout au long de ces expériences. La lyse des cellules n'a pas été induite par les inhibiteurs Cela suggère que les cellules non cultivables peuvent développer des cellules résistantes aux autolysines.

Conclusion

la température peut être le facteur de détermination dans la resuscitation de cette survie, ou l'adaptation, de certaine espèce dans des environnements estuarine, sans l'addition de substances nutritives.

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