Méthodes de recherche et de dénombrement des légionelles dans l’eau Docteur Cyrille NEYRET Institut Pasteur de la Guadeloupe

Institut Pasteur de la Guadeloupe - 23 novembre 2006 Prélèvements (FD T90-522) : Modalités de prélèvements Transport des échantillons Méthode par culture (NF T90-431) : Principe Interprétations des résultats Méthode moléculaire par PCR (XP T90-471) : Avantages Inconvénients Institut Pasteur de la Guadeloupe - 23 novembre 2006

Institut Pasteur de la Guadeloupe - 23 novembre 2006 Prélèvements AFNOR FD T90-522 juillet 2006 : guide applicable aux prélèvements pour la recherche de Legionella sp et L. pneumophila dans les eaux et dans les réseaux d’eau, dans les eaux d’agrément ou de baignade, dans les installations de refroidissement d’air par dispersion d’eau dans un flux d’air (IRDEFA) ou tout autre installation à risque. Institut Pasteur de la Guadeloupe - 23 novembre 2006

Institut Pasteur de la Guadeloupe - 23 novembre 2006 Prélèvements Recommandations concernant les modalités de prélèvement et le choix du point de contrôle : Sur un réseau d’eau : Les points techniques : sortie de production d’eau chaude, retour de boucle, vanne de pied de colonne : flamber et faire couler 2 à 3 minutes partie basse de ballon : faire couler pour chasser les dépôts de la canalisation d’évacuation Les points d’usage : Contrôle de l’exposition : prélever le 1er jet, sans flambage Contrôle des conditions de maîtrise du réseau : prélever après 2 à 3 minutes d’écoulement Institut Pasteur de la Guadeloupe - 23 novembre 2006

Institut Pasteur de la Guadeloupe - 23 novembre 2006 Prélèvements Recommandations concernant les modalités de prélèvement et le choix du point de contrôle : IRDEFA : Sous la responsabilité de l’exploitant (Arrêtés du 13/12/04) Point du circuit de refroidissement où l’eau est représentative de celle en circulation dans le circuit, hors influence directe de l’eau d’appoint (à défaut en amont de la dispersion ou dans le bac) Institut Pasteur de la Guadeloupe - 23 novembre 2006

Institut Pasteur de la Guadeloupe - 23 novembre 2006 Prélèvements Recommandations pour le transport des échantillons : Le plus rapidement acheminés au laboratoire : maximum 24h Enceinte isotherme à 5  3°C (contrôle de la température de l’enceinte si délai > 24h) Echantillonnage : Un litre prélevé dans un flacon stérile Neutralisation des oxydants (thiosulfate de Na) ou des biocides (si possible) Institut Pasteur de la Guadeloupe - 23 novembre 2006

Institut Pasteur de la Guadeloupe - 23 novembre 2006 Méthode par culture Principe : Norme NF T90-431 septembre 1993 Ensemencement direct de l’échantillon Ensemencement d’un concentrat obtenu par filtration Décontamination du concentrat par chauffage, acidification ou les 2, puis ensemencement Incubation de 8 à 10 jours à 37°C Mise en évidence des bactéries du genre Legionella Recherche des Legionella pneumophila Institut Pasteur de la Guadeloupe - 23 novembre 2006

Institut Pasteur de la Guadeloupe - 23 novembre 2006 Méthode par culture Aspects des colonies : Institut Pasteur de la Guadeloupe - 23 novembre 2006

Méthode par culture Résultats et commentaires : Limite de quantification : 250 UFC/L Résultat Commentaire < 250 UFC/L Legionella et L. pneumophila non détectées Legionella et/ou L. pneumophila non quantifiables < 500 UFC/L <500 UFC/L Institut Pasteur de la Guadeloupe - 23 novembre 2006

Institut Pasteur de la Guadeloupe - 23 novembre 2006 Méthode par culture En présence d’une flore interférente : Résultat Commentaire Ininterprétable Présence d’une flore interférente empêchant la détection des Legionella et/ou L. pneumophila < 25 000 Présence de Legionella et/ou L. pneumophila non quantifiables en raison d’une flore interférente < 2 500 (< 5 000) Institut Pasteur de la Guadeloupe - 23 novembre 2006

Institut Pasteur de la Guadeloupe - 23 novembre 2006 Méthode moléculaire Principe : Norme XP T90-471 avril 2006 Concentration des échantillons par filtration ou par centrifugation Lyse, extraction et éventuellement purification de l’ADN des extraits Amplification d’une ou plusieurs séquences d’ADN spécifiques du genre Legionella et/ou de l’espèce L. pneumophila Identification et quantification des amplicons en temps réel Institut Pasteur de la Guadeloupe - 23 novembre 2006

Institut Pasteur de la Guadeloupe - 23 novembre 2006 Méthode moléculaire Avantages par rapport à la culture : Délai de réponse Institut Pasteur de la Guadeloupe - 23 novembre 2006

Institut Pasteur de la Guadeloupe - 23 novembre 2006 Méthode moléculaire Inconvénients par rapport à la culture : Non reconnue pour les contrôles réglementaires Résultats rendus en UG/L (Unité génome) : corrélation avec les UFC/L ? Inhibiteurs dans le prélèvement (Lourdeur de mise en œuvre pour les labos) Institut Pasteur de la Guadeloupe - 23 novembre 2006