Biochimie, Université Paris Descartes PRINCIPES BIOCHIMIQUES DES ICTERES Marie-Anne Loriot Biochimie, Université Paris Descartes PLAN DU COURS Métabolisme de la bilirubine synthèse, captation, conjugaison et excrétion Méthodes de dosage liquides biologiques, valeurs normales, causes d’erreur Variations pathologiques classification des ictères : ictères pré-hépatiques ictères hépato-cellulaires ictères post-hépatiques hyperbilirubinémies héréditaires

INTRODUCTION Bilirubine = produit final de dégradation dans le métabolisme de l’hème Essentiellement dégradation de l’hémoglobine (destruction des GR) et aussi d’autres hémoprotéines (myoglobine, cytochromes, catalases..) Production journalière de 0,5 mmole (300 mg ) Catabolisme: début dans le Système Réticulo-Endothélial et fin dans le foie (macrophages de rate, foie, moëlle) Elimination dans la bile Rôle anti-oxydant: importance chez le Nouveau-Né Elévation de la [bilirubine] plasmatique > 70 mmol/L => coloration jaune des téguments = ICTERE L’ictère n’est pas une maladie c’est un symptôme

Hème des enzymes hépatiques PRINCIPALES ETAPES DU METABOLISME DE LA BILIRUBINE Hémoglobine des GR sénescents Fe Hème 80% HEME CO Oxygénase BILIVERDINE Formation locale de bilirubine qui se produit dans les tissus après un choc ou un coup: les vaisseaux éclatent, libération d’HB après lyse des GR : formation d’un épanchement d’abord coloré en rouge (hème), puis dégradation de l’hème en biliverdine (vert) puis en bilirubine (jaune) On reconnaît les couleurs prises dans une zone d’ecchymose BILIRUBINE Hème des enzymes hépatiques et autres protéines 20%

STRUCTURE DE L’HEME groupement prosthétique des hémoprotéines: hémoglobine, myoglobine et des cytochromes; structure tétrapyrrolique et atome de Fer (Fe2+)

METABOLISME DE LA BILIRUBINE 2 problèmes majeurs dans l’élimination de l’hème - le noyau porphyrine est hydrophobe et doit être solubilisé pour être excrété - le fer doit être conservé pour maintenir le pool de réserve et servir à la nouvelle synthèse d’hème 2 enzymes impliquées dans le catabolisme de l’hème: 1- L’hème oxygénase : enzyme du RE, oxydation et ouverture du cycle, libération de Fe3+ et de CO 2- La biliverdine réductase : cytosolique, réduction d’un pont méthylène Seule reaction de l’organisme qui produit CO, exhalé par les poumons (mesure CO = reflet du catabolisme de l’hème)

* * Cellules du système réticulo-endothélial: foie, rate, moëlle osseuse

(Fe2+) Bleu/vert Jaune/orange M=methyl, P=propionicV=vinyl Changement de couleur de l’hématome Jaune/orange

sous forme d’urobilinogène TRANSPORT PLASMATIQUE ET METABOLISME DE LA BILIRUBINE SYSTÈME RÉTICULO- ENDOTHÉLIAL BILIRUBINE ALBUMINE CAPTATION BILIRUBINE FOIE METABOLISME BILIRUBINE CONJUGUEE Passage dans la bile grâce à un transporteur (ABCC2/MRP2) la captation hépatique fait probablement intervenir un transporteur membranaire Excrétion biliaire=étape limitante, conj et excrétion étroitement coordonnées EXCRETION BILIAIRE Elimination sous forme d’urobilinogène INTESTIN REIN urines bile

METABOLISME NORMAL DE LA BILIRUBINE glucuronidase METABOLISME NORMAL DE LA BILIRUBINE 100-200 m/j Bilirubine conjuguée soluble, excrétée dans l’intestin via les canaux biliaires; formation d’UB incolore par les bactéries intestinales; la majorité de l’UB (90%) est oxydée en stercobiline dans le colon et excrété dans les selles (coloration brune des selles) ; une petite portion d’UB (10%) peut être réabsorbée dans l’intestin grêle = cycle entéro-hépatique de la veine porte; alors que la majorité est excrétée à nouveau dans la bile une partie de l’UB réabsorbé passe dans les urines 4 m/j

CONJUGAISON HEPATIQUE DE LA BILIRUBINE: UGT1A1 Fixation ac glucuronide sur groupement propionyl soit 2 au total car 2 chaînes Dans les hépatocytes, l ’enzyme UDP-glucuronyl transférase (UGT1A1) présente dans le RE lisse ajoute 2 groupements d’acide glucuronique à la bilirubine pour produire les conjugués diglucuronides (ou mono-) = acylglucuronides plus solubles dans l’eau. L’augmentation de la solubilité aqueuse du tétrapyrrole facilite son excrétion biliaire avec les autres pigments biliaires.

bilirubine non conjuguée METHODES DE DOSAGE (1) 1- SERUM OU PLASMA Formes plasmatiques de la bilirubine: bilirubine non conjuguée = bilirubine  "libre ou indirecte "   liaison non covalente à l’albumine bilirubine mono- et diglucuroconjuguée = soluble, non liée bilirubine delta = BC +liaison covalente à l’albumine Diazoréaction => Formation d’azobilirubine BLEU Bilirubine totale Bilirubine directe Bilirubine totale + par différence = bilirubine non conjuguée ± accélérateur - Bilirubine directe Bili NC « indirecte » insoluble dans H20 car obtenue par différence de la bili totale – bili directe qui est soluble La détermination de la bilirubinémie est intégrée au bilan d'exploration hépatobiliaire. Elle permet d'une part d'apprécier l'intensité de l'ictère clinique et d'autre part d'orienter les investigations étiologiques en différenciant les formes conjuguées et non conjuguées. 2- AUTRES LIQUIDES BIOLOGIQUES urines: recherche de bilirubine et d’urobiline (évaluation semi-quantitative par colorimétrie) liquide amniotique : spectrophotométrie directe

METHODES DE DOSAGE (2) 1- SERUM OU PLASMA Valeurs normales : Bilirubine Totale < 17 mmol/L Bilirubine conjuguée < 4 mmol/L Bilirubine non conjuguée < 14 mmol/L Bilirubine delta < 3 mmol/L Causes d’erreur : hémolyse, lipémie, interférences médicamenteuses Nouveau-Né : absence de bilirubine delta Adulte 2- AUTRES LIQUIDES BIOLOGIQUES URINES : sur prélèvement fraîchement émis (<1H) ou + 4°C Résultats récents montrent qu’il existerait un reflux de BC vers le sang via un transporteur ABCC3 et qu’il y aurait une recapture de BC par OATP1B1 et 3 par les hépatocytes adjacents (en aval par rapport au flux sanguin) Absence de bilirubine dans les urines normales ; présence de BC possible mais toujours pathologique Urobilinurie: 3-16 mmol/L (test peu sensible) LIQUIDE AMNIOTIQUE recherche d’incompatibilité fœto-maternelle (groupes sanguins Rhésus) Causes d’erreur : attention au méconium, présence de sérum maternel ou fœtal dans la poche amniotique

VARIATIONS PATHOLOGIQUES CLASSIFICATION DES ICTÈRES : L'augmentation de la concentration de bilirubine circulante se traduit par un ictère clinique dont la gravité dépend de la nature de la fraction de bilirubine augmentée, de l'importance de cette élévation et de l'âge du patient (maturité de la barrière hémato encéphalique). CLASSIFICATION DES ICTÈRES : Selon le mécanisme (étapes du métabolisme de la bilirubine) Selon la pathogénie Ictères pré-hépatiques ou hémolytiques Ictères hépatocellulaires Ictères post-hépatiques (ou par obstruction ou cholestatiques) Hyperbilirubinémies héréditaires chroniques

ICTERES PRE-HEPATIQUES ou HEMOLYTIQUES (1) Origine = destruction excessive de GR circulants, hyperproduction de bilirubine Ictère à bilirubine non conjuguée associant une élévation modérée de la BC; la bilirubine delta est N Ce sont les ictères potentiellement les plus dangereux en raison de la toxicité neurologique de la bilirubine non conjuguée [bilirubine totale] plasmatique 50 à 85 mmol/L (maxi 170 mmol/L) Augmentation de l’urobilinogène urinaire et fécal (selles hypercolorées) Effondrement de l’haptoglobine = meilleur marqueur de la lyse intra-vasculaire Hyper-réticulocytose traduisant le caractère régénératif Absence de signes d’atteinte hépato-cellulaire (sauf en cas de cirrhose) toujours associés à une splénomégalie haptoG= protéine plasmatique fixant l’Hb libre relarguée en cas de lyse des GR (Le taux des réticulocytes traduit l'activité de l'érythropoïèse médullaire Couleur des urines normales

ICTERES PRE-HEPATIQUES ou HEMOLYTIQUES (2) Causes d’hémolyse intra-vasculaire: Anémies hémolytiques chroniques constitutionnelles avec : - maladie de Minkowski-Chauffard ou microsphérocytose héréditaire - maladies génétiques de l'hémoglobine : β-thalassémie et drépanocytose homozygotes - déficits enzymatiques érythrocytaires : déficit en G6PD Anémies hémolytiques acquises d'origine : - toxique (médicaments, toxiques industriels, métaux lourds, venins); - infectieuse ou parasitaire (paludisme); - par fragmentation érythrocytaire (mécanique lors des prothèses valvulaires, traumatique après gros effort (hémoglobinurie), lors de microangiopathies chez l'enfant; – immunologique (transfusion sanguine incompatible, immunisation foeto-matemelle) incompatibilité fœto-maternelle (anti-D): mère Rh(D)-/fœtus Rh+ risque d’atteinte neurologique grave pour le fœtus (bilirubine neurotoxique) traitement préventif de l’alloimmunisation F-M par injection d’Ig anti-D traitement curatif par exsanguino-transfusion à la naissance (formes sévères) ou par photothérapie, induction de la glucuro-conjugaison par phénobarbital La maladie de Minkowski-Chauffard ou microsphérocytose héréditaire ou sphérocytose héréditaire est une maladie génétique, caractérisée par une anomalie des protéines constituant la membrane des globules rouges qui deviennent sphériques et fragiles, avec destruction intrasplénique, entrainant une anémie hémolytique chronique, un subictère et une splénomégalie. G6PD= voie des pentoses phosphate, production de NADPH nécessaire à la synthèse de glutathion, si déficit fragilisation des mb des hématies suite à stress oxydant Chez le NNé ictère néo-natal physiologique dans 30 à 50% des cas, reste < 250microM apparaît 2-3 j après la naissance puis disparaît en moins d’une semaine; chez le prématuré ictère plus fréquent et persiste pendant 2-3 semaines Formes severes: transfusion in utero, accouchement avant terme et exsanguinotransfusion Formes légères: photothérapie, induction UGT par PB; la photothérapie transforme la Bili NC en isomère non toxique (lumirubine)

ICTERES PRE-HEPATIQUES Globules Rouges ICTERES PRE-HEPATIQUES ou HEMOLYTIQUES SRE Hémoglobine Bilirubine non Conjuguée (BNC) Bilirubine Non conjuguée Albumine albumine BNC BC UB Absence de bilirubine dans les urines ≠ avec les ictères hépato-cellulaires Pas de cytolyse hépatique Cycle entéro- hépatique de l’UB Urobilinogène (UB) Urobilinogène urinaire Urobilinogène fécal (stercobiline)

ICTERES HEPATO-CELLULAIRES Origine : atteinte primitive de la fonction hépatique pouvant inclure les 3 étapes majeures du métabolisme hépatique de la bilirubine (captation, conjugaison, excrétion) en l’absence d’hyperproduction; Ictère mixte associant une augmentation simultanée des différentes formes plasmatiques de la bilirubine: bilirubine non conjuguée, BC, bilirubine delta Accompagnement par des signes de cytolyse hépatique : transaminases très élevées Urines hypercolorées et selles N ou décolorées (en fonction de la cholestase) Existence de formes cholestatiques: prédominance de l’atteinte de l’excrétion Causes : 1ère cause = hépatites virales hépatites médicamenteuses (paracétamol) cirrhoses (alcoolique, post-hépatitique, hémochromatosique, biliaire primitive)

Urobilinogène urinaire Bilirubine conjuguée urinaire + Globules Rouges ICTERES HEPATO-CELLULAIRES SRE Hémoglobine Bilirubine non Conjuguée (BNC) Bilirubine Non conjuguée Albumine Augmentation des 3 formes dans le plasma albumine BNC BC UB Défaut de captation+ conjugaison + excrétion Hypercoloration des urines et selles N ou tendance à décoloration On a une cholestase hépatique sans obstruction des voies biliaires Urobilinogène Urobilinogène urinaire Bilirubine conjuguée urinaire + Urobilinogène Fécal stercobiline

ICTERES POST-HEPATIQUES Origine: obstruction de la voie biliaire principale entraînant un reflux de la bilirubine conjuguée (cholestase); production de bilirubine et conjugaison normales Ictères à bilirubine conju)guée associée à une augmentation de la bilirubine delta (BC liée à l’albumine) [bilirubine totale] plasmatique : élévation jusqu’à 500 à 700 mmol/L Bilirubine delta: 30-50% de la bilirubine totale Absence d’excrétion biliaire de la bilirubine pas de formation d’urobilinogène fécal (selles décolorées) Bilan enzymatique: gamma-GT et phosphatases alcalines très élevées Signes cliniques: ictère très sombre, parfois « vert bouteille », urines foncées, presque noires, moussantes, selles blanchâtres graisseuses, « mastic ». prurit, parfois féroce, dû à l'élévation concomitante des sels biliaires dans le sang hépatomégalie Causes : tumeurs (pancréas) lithiases (calculs des voies biliaires) autres : médicaments, cholestase intra-hépatique de la grossesse (3ème trimestre); cirrhoses biliaires primitives

Bilirubine conjuguée urinaire + Globules Rouges ICTERES POST-HEPATIQUES SRE Hémoglobine Bilirubine non Conjuguée (BNC) Bilirubine Non conjuguée Albumine albumine BNC BC Urobilinogène Urobilinogène absent Bilirubine conjuguée urinaire + Urobilinogène fécal absent (selles décolorées)

Forme de Bilirubine élevée ICTERE : Pré-hépatique Hépatique Post-hépatique Forme de Bilirubine élevée NC NC + C C Cause(s) majeure(s) Hémolyse Hépatites virales Médicaments Cholestase Cancer Urines BC _ ++ +++ urobilinogène + puis - Sels biliaires + Couleur urines Normale Foncée Couleur selles N à décolorée Blanches ASAT / ALAT N Très élevées Augmentées PAL 2-3 X N 10-12 X N* * + dosage GGT

HYPERBILIRUBINEMIES HEREDITAIRES CHRONIQUES A- Hyperbilirubinémies à prédominance non conjuguée : déficit de conjugaison 1- maladie de Gilbert 2- maladie de Criggler-Najjar type I/type II B- Hyperbilirubinémies à prédominance conjuguée : défaut d’excrétion, de captation ou de stockage 1- syndrome de Dubin-Johnson 2- syndrome de Rotor

déficit de conjugaison HYPERBILIRUBINEMIES A PREDOMINANCE NON CONJUGUEE : déficit de conjugaison - Maladies liées à une anomalie dans l’activité de glucuro-conjugaison (UGT1A1): diminution partielle ou totale - Existence de polymorphismes génétiques responsables d’une variation de l’activité enzymatique 1- Maladie de Gilbert : ictère bénin, début 15-20 ans ou inaperçu, examen clinique normal * déficit modéré de l’activité UGT1A1, fréquence estimée 15% pop générale * anomalie moléculaire principale: insertion d’un dinucléotide TA dans une séquence répétée en amont du gène UGT1A1 (modification de l’activité transcriptionnelle du promoteur) * [bilirubine non conjuguée] entre 20 et 50 mmol/L * conséquences en thérapeutique: en cas de traitement par des médicaments éliminés après glucuro-conjugaison (exemple: camptothécine= Irinotécan®)

déficit de conjugaison HYPERBILIRUBINEMIES A PREDOMINANCE NON CONJUGUEE : déficit de conjugaison 2- Maladie de Criggler-Najjar : maladie rare, à début précoce Type I * Maladie très sévère liée à un déficit total en activité UGT1A1, à transmission autosomique récessive * Début dès la naissance * [bilirubine non conjuguée] entre 350 et 500 mmol/L * photothérapie inefficace, seul traitement = transplantation hépatique Type II * Maladie moins sévère, déficit partiel en activité UGT1A1, à transmission * Début parfois plus tardif, pronostic favorable * [bilirubine non conjuguée] entre 150 et 300 mmol/L * traitement par le phénobarbital = inducteur de l’activité UGT

HYPERBILIRUBINEMIES A PREDOMINANCE CONJUGUEE : défaut d’excrétion, de captation ou de stockage 1- Syndrome de Dubin-Johnson: ictère familial bénin, autosomique récessif défaut d’excrétion canaliculaire due à une mutation dans un gène codant pour un transporteur= ABCC2 ou MRP2 (famille des « ATP Binding-protein Cassette») Hyperbilirubinémie mixte à prédominance conjuguée avec bilirubinurie : [bilirubine conjuguée] entre 50 et 250 mmol/L test de la BSP (Brome Sulphone Phtaléine): colorant capté par le foie, conjugué et excrété dans la bile ==> reflux secondaire de BSP conjuguée coproporphyrines urinaires normales mais inversion ratio isomères I / III dépôt de type mélanine dans le foie 2- Syndrome de Rotor: autosomique récessif défaut de captation et de stockage hépatiques de la bilirubine (test BSP: diminution de la vitesse de disparition plasmatique et absence de reflux secondaire) mutations dans des transporteurs OATP1B1/3 assurant la recaptation hépatique de BC excrétion urinaire augmentée des protoporphyrines absence de pigmentation des hépatocytes Rotor cliniquement proche de D-J

Ce qu’il faut retenir….. Bilirubine = produit final de dégradation dans le métabolisme de l’hème (foie, SRE); Elimination dans la bile sous forme conjuguée (enzyme hépatique =UGT 1A1); Produits de dégradation: urobiline (urines) et stercobiline (selles); Exploration biochimique: bilirubine totale, non conjuguée et conjuguée; Intégration dans le bilan d’exploration hépato-biliaire pour apprécier l’intensité de l’ictère clinique et orienter les investigations étiologiques en différenciant les formes conjuguées et non conjuguées; Pathologies: ictères 1) ictères pré-hépatiques 2) ictères hépatiques 3) ictères post-hépatiques Ictère du nouveau-né : incompatibilité foeto-maternelle Maladies héréditaires: maladie de Gilbert (bénigne), Criggler-Najjar (grave)

DEMARCHE DIAGNOSTIQUE DES ICTERES