DIAGNOSTIC PRENATAL RAPIDE PAR LA TECHNIQUE DES BACs-on-BEADS (BoBs): UTILISATION EN ROUTINE Unité fonctionnelle de Cytogénétique Hôpital Robert Debré (AP-HP) Paris

Principe de la CGH array Marquage des ADN Analyse des rapports de fluorescence Cy3/Cy5 par un logiciel adapté ADN patient *Cy3 ADN témoin *Cy5 Lavage Lecture par scanner Cohybridation

Prader-Willi / Angelman Wolf-Hirschhorn Cri du Chat Williams-Beuren Langer-Giedion Prader-Willi / Angelman Miller-Dieker Smith-Magenis DiGeorge 13 21 18 Y X

Quelle technologie utilise Prenatal BoBs? ACs n ead BACs on Beads utilise le couplage de sondes d’ADN générées à partir de chromosomes bactériens artificiels (BACs) sélectionnés et amplifiés par PCR, sur les billes Luminex codées par fluorescence. 5 sondes BACs-on-Beads indépendantes sont inclus es pour les chromosomes 13, 18, 21, X et Y et 4 à 8 sondes sont incluses pour chaque région.

J1 Marquage de l’ADN à la Biotine Biotine Random Primer Solution Biotin-dNTP Mix Polymerase Sample Diluent Biotine 5

Kit de purification Purelink INVITROGEN Purification de l’ADN Colonne avec filtre Biotine Kit de purification Purelink INVITROGEN 6

Hybridation de l’ADN sur les billes Dénaturation 5 mn à 85°C Hybridation à 52°C à 1200 rpm 16 à 20H Sonde fixée sur les micro billes Biotine 7

J2 Lavages Elimination de l’ADN non hybridé Wash Buffer 1 Filtre 0,45 µm en µplaque ADN marqué non-hybridé 8

Révélation du signal 37°C 1200 rpm Phycoérythrine Streptavidine Reporter Concentrate Reporter Diluent 37°C 1200 rpm Biotine 9

Lavages Wash Buffer 2 Filtre 0,45 µm en µplaque Streptavidine non couplée 10

Lecture d’une plaque complète = 2h Lectures des billes Lecture d’une plaque complète = 2h 11

Lectures des billes Le laser vert identifie le signal de la phycoérythrine sur l’ADN Le laser rouge identifie le signal de la bille 12

Profil féminin normal

Profil masculin anormal

Notre expérience à Robert Debré

BACs on Beads utilise le couplage de sondes d’ADN générées à partir de chromosomes bactériens artificiels (BACs) sélectionnés et amplifiés par PCR, sur les billes Luminex codées par fluorescence. 5 sondes BACs-on-Beads indépendantes sont inclus es pour les chromosomes 13, 18, 21, X et Y et 4 à 8 sondes sont incluses pour chaque région.

Nos résultats De avril 2011 à juillet 2012

Intérêts Rendu de résultats rapide Seulement ? ng d’ADN nécessaire soit 2mL de LA ou 1 petite villosité Comparaison avec des références mâles et femelles Jusqu’à 44 patients par plaque Jusqu’à 100 sondes par puits dont 4 à 8 sondes par région étudiée Screening plus large (dont contrôles sur quelques autosomes)

Exemple d’une découverte d’une tétrasomie 12p chez un fœtus

Exemple d’une découverte d’une délétion 7q11 (Sd de Williams) chez un fœtus présentant un RCIU à 34SA

Inconvénients Non détection des translocations équilibrées ? Difficulté d’interprétation des triploïdies Technique très manuelle Technique coûteuse ? Certaines microdel étudiées inutiles ?

Exemple d’une triploïdie chez un fœtus