FACULTE DES SCIENCES Département de biologie MASTER 2 Alimentation et Nutrition Thème Conception des amorces encadrant le SNP rs6234 du gène PCSK1 associé à l’obésité Présenté par : Encadrée par : Mme Brahami N Mahi Aïcha

Plan Introduction L’obésité Proprotéine convertase type 1 (PC1) Polymérase Chaine Réaction (PCR) objectif But de l’étude Matériels et méthode Résultats Conclusion

Introduction L’obésité est reconnue comme un problème majeur de santé publique . C’est une maladie multifactorielle , associant des facteurs psychologiques , environnementaux et génétiques . Plusieurs gènes sont impliqués dans l’étiologie de celle-ci , comme le gène de la leptine , le gène FTO et le gène PCSK1.

le variant rs6234 , le variant rs6235 . Plusieurs études ont démontré l’association de nombreux variants du gène pcsk1 à l’obésité tels que le variant rs6232 , le variant rs6234 , le variant rs6235 . Ces études d’association ont été réalisé grâce à un outil important qu’est la PCR .

L’obésité

Définition IMC (Kg/m²) = Poids (Kg) / Taille au carré (m) ² L’obésité est définie comme un état pathologique caractérisé par un excès des graisses de réserve , représentées essentiellement par les triglycérides stockés dans le tissu adipeux blanc. l’obésité est définit par l’indice de masse corporelle IMC > 30 est calculé selon la formule : La définition de l’obésité est basée sur une augmentation de la masse grasse qui représente, normalement, chez l’adulte jeune 10 à 15 % du poids corporel chez l’homme, 20 à 25 % du poids corporel chez la femme. Cependant, la mesure de la masse grasse étant difficilement objectivable en pratique médicale courante l’obésité se définit aujourd’hui par l’indice de masse corporelle (IMC) qui se calcule en divisant le poids (en kilos) par la taille (en mètre) au carré : (FRÉDÉRIC SANGUIGNOL, 2008) IMC (Kg/m²) = Poids (Kg) / Taille au carré (m) ² (Tableau I) Classification des obésité selon l’IMC IMC (Kg/m²) = Poids (Kg) / Taille au carré (m) ² 1

Différents types d’obésité Il existe 3 formes d’obésité: gynoïdes mixtes androïdes l'excès de graisse est concentré au niveau du tronc et de l'abdomen . les graisses se localise au niveau des hanches et des cuisses. combinent les deux formes précédentes d'obésité (I.M.C. > 40)

Facteurs de risques L’obésité est une maladie multifactorielle : Facteurs héréditaires  Facteurs alimentaires facteurs génétiques Facteurs psychologiques Facteurs environnementaux

Prévalence de l’obésité Prévalence de l’obésité en Algérie Prévalence de l’obésité Dans le monde L’obésité est devenue un problème de santé à l’échelle mondiale. Aux Etats –Unis , les obèses représentent 33% de la population . En Europe , la prévalence varie de 4,0 à 28,3% chez les hommes et 6,2 à 36,5% chez les femmes Selon une étude réalisée en 2002 , le taux d’obésité en Algérie est de 55,9 % 41 % d’hommes 66,5 % des femmes

Proprotéine convertase type 1 (PC1) PC1

Définition La Proprotéine convertase 1 ou PCSK1 « Pro-protéine convertase subtilisine / kexine de type 1 » c’est une neuroendocrine convertase Ca2+ dépendante appartenant à la famille des endoprotéases à sérine de type subtilisine et composée de 753 acides aminés .

Structure de proprotéine convertase 1

Expression de proprotéine convertase 1 cerveau La PC1/3 est principalement exprimée dans le cerveau , les cellules enteroendocrines et le système neuroendocrine. hypophyse Elle joue un rôle essentiel dans la maturation de plusieurs hormones clés qui régulent la prise alimentaire au niveau du cerveau comme l'insuline , le glucagon .

Localisation chromosomique du gène pcsk1 Le gène PCSK1 est localisé dans un intervalle de 5,6 Mb , lié à l’obésité dans la population européenne, se trouve sur le bras long (q) du chromosome 5 entre les positions 15 et 21 (5q15-q21) et contient 17 exons .

Les SNP du gène pcsk1 associés à l’obésité Plusieurs études ont démontré l’association de nombreux variants du gène pcsk1 à l’obésité . Code le changement d’acide aminé asparagine en acide aspartique (N 221 D) . rs6232 Code le changement d’ acide aminé glutamine en acide glutamique (Q665E) rs6234 Code la substitution Sérine par la Thréonine (S690T) rs6235

Localisation des SNP au niveau du proprotéine PC1

Polymérase Chaine Réaction ( PCR )

Définition La PCR c’est une technique d'amplification enzymatique (grâce à la Taq polymérase) qui permet à partir d’une faible quantité d'ADN d'obtenir un grand nombre de copies identiques d’un fragment cible de cet ADN . Outils nécessaires au bon fonctionnement

Technique Tous les éléments nécessaires à la réaction sont regroupés dans un tube PCR sera soumis aux différentes températures correspondant à chaque étape. Ces cycles de température sont réalisés automatiquement dans un thermocycleur .

Les étapes Dénaturation (94 à 95°C)

Hybridation (40 à 65°C) L'hybridation des amorces sur l'ADN repose sur le principe de l'appariement des bases complémentaires .

Elongation (72°C) synthèse d'un nouveau brin par la Taq polymérase à partir des amorces et des dNTP libres. Il en résulte deux ADN bicaténaires. Cette étape se déroule généralement à la température optimale à l’action de l’ADN polymérase : 72°C.

Les critères du choix des amorces de PCR Les amorces sont choisies de façon à encadrer la séquence d'ADN à amplifier et doit répondre aux nombreux critères pour que la PCR soit réussie . Séquence spécifique à la zone d’intérêt Les températures de fusion (Tm) des amorces sens et antisens doivent être identiques.

La taille des amorces doit être comprise entre 12 et 30 nucléotides. La distance entre les deux amorces sur l’ADN à amplifier doit être comprise entre 10 pb et 10 kpb. L’absence de structure secondaire interne. La séquence des amorces doit comporter la plus grande proportion possible de guanines et de cytosines (GC : 40 à 60%)

Objectif Nous allons concevoir avec spécificité le couple d’amorce encadrant le SNP rs 6234 du gène PCSK1 associé à l’obésité dans la population européenne.

But Le couple d’amorces conçue au cours de ce travail serviras à étudier l’implication du rs 6234 dans l’obésité chez la population Algérienne ; lors d’études ultérieurs cas-témoins.

Matériels et Méthode

Recherche de la séquence de référence du gène PCSK1 Site  «www.ensembl.org »

Configuration de la séquence

Résultats de la Configuration de la séquence

Séquence de la région encadrant le SNP rs 6234

Le design des Primers Dans les ressources  du  National  Center  for  Biotechnology Information  (NCBI)  nous avons utilisé le logiciel Primer blast dans le site « www. ncbi .nlm. nih. Gov » afin de concevoir les amorces recherchés.

Résultats

Résultats de la conception des amorces Grâce au logiciel primer - BLAST nous avons obtenus 5 couples d’amorces.

Nous avons choisie la 2ème paire d’amorces , puis-qu’elle donne un seul produit de 233 pb donc ces amorces sont bien spécifiques .

Amorces spécifiques (en vert) encadrant le SNP rs6234.

Confirmation des résultas Nous avons soumis les séquences des amorces a une analyse de confirmation qui se fait par le site « http:/www. genome .ucsc. edu / » .

Résultats de confirmation Les résultats de cette confirmation donne un produit situé sur le chromosome 5 donc ces résultats nous confirment la fiabilité et la spécificité des amorces que nous avons obtenue .

Conclusion L’évolution des fréquences du surpoids et de l’obésité est probablement liée au mode de vie . Donc il important de trouver des causes moléculaire à cette obésité croissante en Algérie cela ce fait par des études d’association . En effet le variant rs 6234 codant le changement d’acide aminé (Q665E) a été montré pour être systématiquement associée à un risque d'obésité .

Il est important de bien concevoir les amorces avant toute manipulation ultérieure concernant l’étude cas témoins en Algérie. Pour cela il existe plusieurs outils de la bioinformatique qui permettent de retrouver les séquences de référence de n’importe quel gène et de concevoir des amorces spécifiques .

Merci de votre attention