Les milieux de culture L’ ensemencement

Définition Les milieux de culture sont des mélanges de substances, qui sont capable d’assurer la multiplication des bactéries dans le laboratoire. Les élèments de bas entrant dans la préparation des milieux de culture: - L’eau - Les sel minéraux - Les nutriments ( constitutifs et énergétiques)

Attention !! Le milieu doit assurer les conditions optimales pour le métabolisme bactérien (ph, pression osmotique, aérobie ou anaérobie, potentiel redox) et il doit être sterile.

Les nutriments Peptones: sont des produits issue de hydrolyse de protéines Infusion au extrait de viande: base des bouillons de culture Mélanges de protéines natives: l’oeuf, le sérum du sang ou le sang sans la fibrine

Les agents solidifiant L’agar-agar ( extraite d’algues) Autres agents solidifiant : la gélatine, le gel de silice, les oeufs coagulés (pour le milieu Löwenstein-Jensen), le sérum coagulé

Un milieu minimum est un milieu comportant les éléments chimiques strictement nécessaires à la croissance bactérienne, sous une forme utilisable par des bactéries n'ayant pas d'exigence particulière

Composition d'un milieu minimum: Une source de carbone et d'énergie, généralement le glucose. Une source de potassium et de phosphore: K2HPO4 Une source d'azote et de soufre: (NH4)2SO4 Une source de magnésium: MgCl2 Une source de calcium: CaCl2 Une source de fer: on emploie le citrate de fer (le citrate a pour rôle de maintenir le fer en solution) Une source d'oligo-élements: sels de Cu, Zn, Co, Ni, B, Ti Une source d'eau, indispensable à toute forme de vie: on utilise l'eau distillée (stérile) Un tampon pH: il permet de maintenir un pH correct voire optimum: K2HPO4 par exemple En l'absence de l'un de ces composants, les bactéries ne se développent pas, car elles ne peuvent pas synthétiser ces produits.

Caractéristiques des milieux de culture Les milieux de culture doivent pour permettre le développement des micro-organismes réunir certaines qualités. Ils doivent, en particulier: -  contenir en quantité suffisante tous les nutriments et l'eau exigés par leur croissance et leur entretien et respecter leur besoin en oxygène.

Les micro-organismes sont classés en : - aérobies stricts qui ne se développent qu'en présence d'oxygène. Une large surface de contact des milieux avec l'air doit être prévue; - anaérobies stricts qui périssent en présence d'oxygène. La surface de contact du milieu avec l'air doit être aussi petite que possible parfois même recouverte d'une substance qui l'en protège. Le milieu lui-même peut être privé de l'air dissous par ébullition ou additionné d'une substance avide d'oxygène Dans certains cas les cultures sont pratiquées sous vide ou dans une atmosphère de gaz inerte - aéro-anaérobies facultatifs présentant des caractères intermédiaires donc des exigences moins grandes et en particulier supportant l'oxygène

ATMOSFERA DE CO2 5-10%

Caractéristiques des milieux de culture - être ajusté à un pH précis; - être porté à la température optimale de croissance. La croissance de certains micro-organismes nécessite en outre soit des substances particulières comme les facteurs de croissance (comparables aux vitamines), soit une atmosphère enrichie en gaz carbonique.  

Le bactériologiste utilise des milieux de culture pour isoler les bactéries du milieu qui les contient,  les identifier, étudier leurs propriétés et, éventuellement  les conserver Les milieux de culture utilisés peuvent être obtenus de différentes façons. Ils peuvent être: - Achetés, conditionnés, prêts à l'emploi. Cette solution même si elle est onéreuse est valable que pour les laboratoires ayant une consommation limitée et régulière de milieux d'usage courant. Elle s'impose le plus souvent pour certains milieux dont la préparation est délicate et complexe.

Préparés à partir des différents ingrédients entrant dans leur formule Préparés à partir des différents ingrédients entrant dans leur formule. La formule d'un milieu ressemble un peu à une recette de cuisine, chaque détail de son exécution doit être respecté. - Préparés à partir de milieux secs déshydratés. Cette technique permet de concilier une préparation simple, rapide, pratiquement sans risque d'erreurs et un prix de revient relativement bas. - Préparés, juste au moment de l'utilisation sous leur forme définitive. Certains milieux exigent, juste avant leur emploi, l'addition de substances périssables, d'autres, un conditionnement n'autorisant qu'un court délai de conservation, etc.

Présentation des milieux en boîtes de pétri De nombreux milieux de culture doivent être, pour leur utilisation écoulés en couche mince au fond de boîtes plates et rondes en verre ou, le plus souvent en matière plastique appelées boîtes de Pétri. Le délai de conservation des milieux ainsi présentés n'excède pas trois ou quatre jours aussi leur répartition doit-elle précéder de peu leur emploi.

La clasification des milieux de culture Selon l’état physique – milieux liquides - milieux solides Selon leur composition: milieux usuels, milieux avec des protéines natives, Milieux d’enrichissement, milieux sélectifs, milieux pour les anaérobies, milieux pour les réactions biochimiques -

milieu liquide

milieux solides

L’agar nutritif

Classification des milieux en fonction de leur utilisation On peut classer les milieux en 4 catégories: - milieux usuels dits de base milieux d'isolement milieux d'identification milieux de conservation.

Milieux usuels dits de base Ces milieux permettent la culture d'une variété de bactéries aussi grande que possible, mais il n'existe pas de milieu universel. Le choix d'un milieu usuel est en général fonction de l'habitat naturel des bactéries à isoler ou conditionné par l'examen microscopique direct du produit étudié. En bactériologie médicale on utilise souvent des milieux à base d'extrait de viande pour la culture de la plupart des microbes commensaux ou pathogènes de l'homme et des animaux.

Les milieux les plus utilisés sont le bouillon nutritif et la gélose nutritive (bouillon additionné de gélose à raison de 20 g environ par litre). Le bouillon nutritif est une macération de viande additionnée de peptones (15 à 20 g par peptones/litre) et légèrement salée (5 g par litre). Les peptones sont obtenues en dégradant les protéines de tissus animaux ou végétaux jusqu'au stade des acides aminés directement assimilables par les bactéries. En bactériologie agricole on utilise des milieux à base de lait, d'extraits végétaux, etc.

Milieux d'isolement Ces milieux, qui permettent d'obtenir les bactéries contenues dans un produit naturel à l'état de culture pure, peuvent être: Les milieux de base usuels précédemment cités. Les milieux de base enrichis de produits biologiques: sang, suppléments polyvitaminiques, sérum. Ces milieux enrichis facilitent l'isolement des bactéries fragiles et exigeantes à partir des produits pathologiques. Les milieux électifs et sélectifs qui favorisent la culture d'une espèce ou d'un groupe d'espèces bactériennes alors que la croissance des autres bactéries est difficile, entravée, ou nulle.

Les milieux sélectifs - ont additionné de différentes substances qui acquièrent la propriété d’inhiber la culture de certaines espèces sans modifier la pousse d’une ou de quelques espèces privilégiées. Par exemple: - milieu Chapman solide (avec 7,5 % NaCl) pour staphylocoques - milieu Tinsdale – pour le bacille de la diphtérie - milieu Löwenstein – Jensen – pour le Mycobacterium tuberculosis - milieu Sabouraud – pour les fungus - milieux sélectifs avec la lactose pour les Entérobactéries: Drigalski, Levin, Leiffson, Mac Conkey, Istrate Meitert, CLED, etc.

Les milieux d’enrichissement Il s’agit de milieux liquides qui permettent, après l’incubation à la température désirée, d’obtenir une multiplication importante de certaines espèces bactériennes. Par exemple: - milieu Chapman liquide (avec 15 % NaCl) pour les staphylocoques - milieu OCST (oeuf – cystéine – sérum – tellurite de potassium) pour le bacille de la diphtérie - milieu avec sélénite acide de sodium – pour les Salmonella - milieu l’eau peptonée pH - 9 pour les vibrions

Les milieux d'identification L'identification des bactéries est surtout basée sur l'étude de leurs propriétés biochimiques. Cette étude est rendue possible par la culture de la souche bactérienne sur un grand nombre de tubes de milieux spéciaux. On observe  la modification des milieux soit directement, soit grâce à des indicateurs chimiques, puis on rassemble tous les renseignements obtenus sous forme d'une fiche signalétique qui permet d'établir l'identité de la bactérie en cause. On appelle galerie bactérienne l'ensemble des milieux permettant l'identification d'une bactérie.

galerie bactérienne (l'ensemble des milieux permettant l'identification d'une bactérie)

Milieu pour l’antibiogramme diffusymetrique

Milieu liquide- bouillon nutritif Categoria: Mediu de bază Componente: macerat de carne + peptonă + NaCl 0,5% Utilizare: pentru germeni nepretenţioşi

Agar nutritif Categoria: Mediu de bază Componente: bulion simplu + agar-agar

Agar nutritif Categoria: Mediu de bază Componente: bulion simplu + agar-agar

Agar lactosé Categoria: Mediu sélectif Componente: geloză simplă + lactoză + albastru bromtimol Utilizare: studierea fermentării lactozei

Agar sang Categoria: milieu avec proteines natives Componente: geloză simplă răcită la 45°C + sânge defibrinat 10- 20%

Agar chocolat Categoria: Mediu special Componente: geloză simplă răcită la 60-80°C + sânge Utilizare: cultivarea neisseriilor, hemofililor

Milieu Chapman Categoria: Mediu selectif şi diferenţial (evidentiaza o proprietate biochimica a tulpinii) Componente: geloză simplă + NaCl 7,5% + manitol + roşu fenol Utilizare: selectiv pentru stafilococ

Mediul Chapman

Milieu Levine Categoria: Mediu selectiv şi diferenţial Componente: geloză simplă + eozină + lactoză + albastru de metilen Utilizare: cultivarea enterobacteriilor (E.coli)

Mediul OCST Categoria: Mediu de îmbogăţire (favorizeaza X bacteriilor, mai ales cand acestea sunt in concentratie mica) Componente: ou + cisteină + ser + telurit de potasiu Utilizare: cultivarea bacililor difterici

Mediul Sabouraud Categoria: Mediu special Componente: geloză simplă + maltoză/glucoză + antibiotice Utilizare: cultivarea levurilor

Mediul Lowenstein-Jensen

les principaux procédés d'ensemencement

les principaux procédés d'ensemencement ensemencement dans la masse

ensemencement par stries transversales pour dissémination:

ensemencement par stries épaisses

ensemencement par inondation:

ensemencement par piqûre et par touche