Culture cellulaire et métrologie : jusqu’où faut-il aller ? Françoise Esclaire Cytogénéticienne - Responsable Qualité Laboratoire du CHU de Limoges XXVIIème Colloque ATC 14-15 septembre 2017 Limoges Colloque ATC – 14-15 septembre 2017

Culture cellulaire Métrologie Colloque ATC – 14-15 septembre 2017

Caryotype : 1ère étape = culture cellulaire critique Prélèvement de bonne qualité Milieu de culture adapté Technicien compétent Incubateur à CO2 Hotte à flux laminaire Colloque ATC – 14-15 septembre 2017

Amélioration continue Accréditation de la biologie médicale Accréditation du Caryotype prénatal Maitrise des processus Maitrise des compétences Maitrise des conditions environnementales Gestion des risques Maitrise des réactifs Amélioration continue Maitrise des équipements Colloque ATC – 14-15 septembre 2017

Maitrise des équipements critiques Incubateurs pour la culture des liquides amniotiques et villosités choriales => 2 paramètres à maitriser : Température 37°C Taux de CO2 5% Surveillance en continu ? Avec quelle « précision » de mesure ? justesse ? Exactitude ? fidélité ?

Surveillance des paramètres de culture Dans la plupart des LBM : achat d’une centrale de surveillance avec sondes de température / CO2 / hygrométrie Intérêt pour nos incubateurs de culture cellulaire : surveillance en continu avec alarmes en cas de dépassement des seuils fixés + possibilité de report d’alarme pendant les heures de fermeture du laboratoire Colloque ATC – 14-15 septembre 2017

Gestion des sondes de température et de CO2 valeurs cibles « historiques » pour la culture des cellules humaines Température 37°C Taux de CO2 5% Quels sont nos EMT ? Quel écart tolère-t-on par rapport à nos valeurs cibles ? 37°± 1° Données bibliographiques très pauvres (rien dans GBPC) Selon les sources : 5% ± 1% (le plus courant) 5% ± 2% Attention : plus l’écart maximal toléré (EMT) est restreint, plus la sonde doit être performante ! 5% à 15 % Colloque ATC – 14-15 septembre 2017

Gestion des sondes de température et de CO2 Comment s’assurer que les sondes disent « vrai » ? Étalonnage Il faut les comparer à un étalon Est-ce que l’écart de la sonde par rapport à l’étalon est acceptable en fonction de mes besoins ? Constat de vérification En fonction des exigences que j’ai définies pour le taux de CO2 dans mon incubateur (EMT) => Sonde CONFORME ou NON CONFORME Colloque ATC – 14-15 septembre 2017

Etalonnage des sondes CO2 Attention !!! Si EMT de l’incubateur 5% ± 1% EMT de la sonde : 0,25 % Est-ce que pour autant on maitrise mal nos conditions de culture cellulaire ??? Risque +++ que le constat de vérification conclue « sonde non conforme » Le mieux est l’ennemi du bien… Colloque ATC – 14-15 septembre 2017

Quelles solutions pour la maitrise du taux de CO2 ? Elargir nos EMT ? Culture sous 5% à 10 % de CO2 par exemple ? Mais la valeur cible devient alors 7,5% (avec EMT ± 2,5%) => Comment justifier qu’on ne respecte pas le standard « historique » de 5% pour la culture cellulaire ??? Il faut faire des études de robustesse pour justifier ! = long et coûteux !!! Comparaison de cultures en parallèle : 5% vs 7,5% 5% vs 10% Comparaison de cultures primaires : nombre de clones ? Comparaison après repiquage : rapidité d’obtention de la confluence ? Possible si on fait un travail collaboratif à l’échelle de nombreux laboratoires => objectif : faire évoluer les standards ! Colloque ATC – 14-15 septembre 2017

Quelles solutions pour la maitrise du taux de CO2 ? Cesser de faire étalonner nos sondes ? Car notre besoin en culture cellulaire n’est pas d’avoir exactement un taux de CO2 donné dans nos incubateurs Mais de fournir du CO2 aux cellules pour qu’elles puissent réguler leur pH ! CO2 + H2O <=> H2CO3 <=> H+ + HCO3- => Ce qui est critique en réalité c’est de maintenir le pH entre 7,2 et 7,4 Donc l’élément critique pour nos incubateurs, c’est d ’avoir du CO2 mais pas de mesurer précisément le taux de CO2 ! Oui mais comment surveiller le pH de nos cultures si on ne surveille plus « précisément » le taux de CO2 ? Colloque ATC – 14-15 septembre 2017

Quelles solutions pour la maitrise du taux de CO2 ? Surveillance du pH de nos cultures : En surveillant l’indicateur coloré de nos milieux de culture ? Mais risque de constater trop tard un problème !!! En mesurant régulièrement le pH du surnageant de nos cultures ? Solution choisie par certains labos de PMA pour s’affranchir de la question de la mesure du taux de CO2 dans leurs incubateurs ! Mais chronophage !!! En surveillant l’affichage du CO2 mesuré par le système interne de l’incubateur ? Sachant que les incubateurs récents utilisent une technologie très performante pour la mesure du CO2 (sprectro infra-rouge) A priori plus performante que la technologie de certaines sondes externes ! Colloque ATC – 14-15 septembre 2017

Et l’accréditation dans tout cela ? Y a-t-il des laboratoires accrédités pour le caryotype qui ne font pas étalonner leurs sondes CO2 ? Pourrait-on mutualiser nos réflexions pour avoir une position homogène vis-à-vis des exigences de l’accréditation ? Rendez-vous sur les forums de l’ATC et de l’ACLF !!! Colloque ATC – 14-15 septembre 2017

Et l’accréditation dans tout cela ? Y a-t-il des laboratoires accrédités pour le caryotype qui ne font pas étalonner leurs sondes CO2 ? Pourrait-on mutualiser nos réflexions pour avoir une position homogène vis-à-vis des exigences de l’accréditation ? Rendez-vous sur les forums de l’ATC et de l’ACLF !!! Colloque ATC – 14-15 septembre 2017

PS : pour la surveillance de température des enceintes froides Outils proposés par un membre de l’ATC pour s’affranchir de l’achat et de l’étalonnage de sondes externes : Réfrigérateur Température cible : +5°C Congélateur Température cible : -20°C Colloque ATC – 14-15 septembre 2017