BIODEGRADATION DE LA SULCOTRIONE PAR UNE SOUCHE BACTERIENNE ISOLEE D’UN SOL AGRICOLE Laboratoire de Chimie des Biomolécules et de l’Environnement (LCBE EA 4215), Equipe Chimie de l’Environnement. Christophe CALVAYRAC, Cédric BERTRAND, Camille-Michel COSTE et Jean-François COOPER. 43ème congrès du GFP « Protection des cultures, Environnement, Santé et Bio-diversité : constats et perspectives »  29-31 Mai 2013

PLAN 1- CONTEXTE DE L’ETUDE 2- STRATEGIE D’ISOLEMENT 3- LES PROPRIETES BIOLOGIQUES DE L’ISOLAT 3.1- Caractérisation du potentiel de biodégradation 3.2- Caractérisation génétique 4- CONCLUSION ET PERSPECTIVES 43ème congrès du GFP « Protection des cultures, Environnement, Santé et Bio-diversité : constats et perspectives »  29-31 Mai 2013

1- CONTEXTE DE L’ETUDE Famille : Herbicide β-TRICÉTONE Formule brute : C14H13ClO5S Masse molaire : 328,7 g.mol-1 IUPAC : 2-(2-chloro-4-mésylbenzoyl)cyclohexane-1,3-dione CAS : 1,3-cyclohexanedione, 2-[2-chloro(4-méthylsulfonyl) benzoyl] Activité biologique : Herbicide SYSTÉMIQUE à sélectivité MÉTABOLIQUE Contrôle des adventices dicotylédones et certaines graminées annuelles Homologué en France sur maïs, lin, ray-grass, sorgho et maïs doux Sulcotrione 43ème congrès du GFP « Protection des cultures, Environnement, Santé et Bio-diversité : constats et perspectives »  29-31 Mai 2013

1- CONTEXTE DE L’ETUDE POINT DE DEPART: Etude de la dégradation de la sulcotrione en conditions contrôlées de laboratoire à partir de microcosmes de sol (Perpignan) * Dégradation de la substance active sur « sol vivant »(DT50 ≈ 8 jours) *Apparition concomitante de produits de dégradation, et notamment ,l’acide 2- chloro-4 methylsulfonyl benzoïque (CMBA) → PROCEDURE D’ISOLEMENT DE SOUCHES DEGRADANTES A PARTIR DE CE SOL AGRICOLE 43ème congrès du GFP « Protection des cultures, Environnement, Santé et Bio-diversité : constats et perspectives »  29-31 Mai 2013

2- STRATEGIE D’ISOLEMENT DE LA SOUCHE L’approche cultivable, 3 étapes clés… ÉTAPE 1 Utilisation de la matrice sol (C) supplémenté en sulcotrione comme milieu de culture initial OBJECTIFS : - S’affranchir au maximum de la difficulté de culture des microorganismes telluriques sur milieu de culture synthétique - Sélectionner des microorganismes telluriques «tolérants» vis-à-vis de l’herbicide ÉTAPE 2 Cultures dans un milieu sélectif synthétique adapté : Milieu minéral supplémenté en sulcotrione OBJECTIF : Sélectionner, parmi les souches «tolérantes», celles qui sont capables d’utiliser l’herbicide comme seule source de carbone et/ou d’énergie. ÉTAPE 3 Cultures répétées avec pression de sélection de l’herbicide OBJECTIF : Optimisation de la croissance et de l’adaptation des souches sélectionnées, VIA un métabolisme direct. 43ème congrès du GFP « Protection des cultures, Environnement, Santé et Bio-diversité : constats et perspectives »  29-31 Mai 2013

2- STRATEGIE D’ISOLEMENT DE LA SOUCHE = Protocole d’isolement de souches bactériennes telluriques sulcotrione-tolérantes ÉTAPE 1 Souches Pures 43ème congrès du GFP « Protection des cultures, Environnement, Santé et Bio-diversité : constats et perspectives »  29-31 Mai 2013

2- STRATEGIE D’ISOLEMENT DE LA SOUCHE = Cultures répétées des isolats sulcotrione-tolérants avec pression de sélection de l’herbicide ÉTAPE 2 ÉTAPE 3 43ème congrès du GFP « Protection des cultures, Environnement, Santé et Bio-diversité : constats et perspectives »  29-31 Mai 2013

2- STRATEGIE D’ISOLEMENT DE LA SOUCHE = Protocole de sélection de souches bactériennes dégradant la sulcotrione après cinq cycles de cultures répétées + sulcotrione ESSAIS DE BIODÉGRADATION 4 ÉTAPE 2 ÉTAPE 3 43ème congrès du GFP « Protection des cultures, Environnement, Santé et Bio-diversité : constats et perspectives »  29-31 Mai 2013

3- LES PROPRIETES BIOLOGIQUES DE L’ISOLAT: Potentiel de biodégradation RÉSULTATS : Suivi de la croissance des souches 1OP vs 1TRANS dans le milieu de culture (MS) SUPPLÉMENTÉ EN SULCOTRIONE (98 µM) par mesure de l’absorbance à 600 nm. 43ème congrès du GFP « Protection des cultures, Environnement, Santé et Bio-diversité : constats et perspectives »  29-31 Mai 2013

3- LES PROPRIETES BIOLOGIQUES DE L’ISOLAT: Potentiel de biodégradation RÉSULTATS : Suivi de la dissipation de la sulcotrione et de l’accumulation de l’acide 2-chloro-4 methylsulfonyl benzoïque (CMBA) en fonction du temps dans le milieu de culture (MS) supplémenté 43ème congrès du GFP « Protection des cultures, Environnement, Santé et Bio-diversité : constats et perspectives »  29-31 Mai 2013

3- LES PROPRIETES BIOLOGIQUES DE L’ISOLAT: Potentiel de biodégradation 1- RECHERCHE DE CONDITIONS DE CULTURES LIQUIDES OPTIMISEES POUR L’ISOLAT 1OP: *Δ pH: pH 5, pH 7 et pH 8 *Δ Concentration initiale en sulcotrione: 15, 46, 91, 183, 305 et 457 µM 43ème congrès du GFP « Protection des cultures, Environnement, Santé et Bio-diversité : constats et perspectives »  29-31 Mai 2013

3- LES PROPRIETES BIOLOGIQUES DE L’ISOLAT: Potentiel de biodégradation RÉSULTATS : - Croissance de l’isolat observé pour les 3 gammes de pH étudiées - pH 7 retenu dans nos conditions opératoires 43ème congrès du GFP « Protection des cultures, Environnement, Santé et Bio-diversité : constats et perspectives »  29-31 Mai 2013

3- LES PROPRIETES BIOLOGIQUES DE L’ISOLAT: Potentiel de biodégradation RÉSULTATS : - Utilisation du modèle de GOMPERTZ modifié (Zwietering et al., 1990) Vitesse de croissance de la culture maximale pour une concentration en sulcotrione de 183 µM Ralentissement de la vitesse de croissance au-delà de cette concentration 43ème congrès du GFP « Protection des cultures, Environnement, Santé et Bio-diversité : constats et perspectives »  29-31 Mai 2013

3- LES PROPRIETES BIOLOGIQUES DE L’ISOLAT: Potentiel de biodégradation 2- ESSAI DES CAPACITES BIODEGRADANTES DE L’ISOLAT 1OP SUR D’AUTRES COMPOSES: *Tembotrione (2-[2-chloro-4-mesyl-3-((2,2,2-trifluoroethoxy)methyl)benzoyl]cyclohexane-1,3-dione) RÉSULTAT : - Absence de dégradation de la tembotrione *CMBA RÉSULTAT : - Absence de dégradation du CMBA 2-chloro-4-mesylbenzoic acid (CMBA). 43ème congrès du GFP « Protection des cultures, Environnement, Santé et Bio-diversité : constats et perspectives »  29-31 Mai 2013

3- LES PROPRIETES BIOLOGIQUES DE L’ISOLAT: Caractéristiques génétiques PRINCIPE : Typage de l’ADN des deux isolats bactériens 1OP et 1TRANS 1/ IDENTIFICATION TAXONOMIQUE PAR UTILISATION DES TECHNIQUES D’EMPREINTES MOLÉCULAIRES : MÉTHODOLOGIE 1 : CIBLAGE DES GÈNES CODANT LES ARNr 16S. DE QUELLE MANIÈRE ? Technique de l’ARDRA (Amplified Ribosomal rDNA Restriction Analysis). MÉTHODOLOGIE 2 : CIBLAGE DES SÉQUENCES REP (REPETITIVE EXTRAGENIC PALINDROMIC SEQUENCES) PRÉSENTES DANS LA TOTALITÉ DU GÉNOME. DE QUELLE MANIÈRE ? Technique de REP-PCR = amplification par PCR des séquences REP. M1 M2 43ème congrès du GFP « Protection des cultures, Environnement, Santé et Bio-diversité : constats et perspectives »  29-31 Mai 2013

3- LES PROPRIETES BIOLOGIQUES DE L’ISOLAT: Caractéristiques génétiques Analyse du polymorphisme de séquence des ADNr 16S amplifiés des isolats (ARDRA) Profils de restriction identiques pour les deux isolats ! Empreintes ARDRA des isolats 1OP et 1TRANS générées après digestion des ADNr 16S par Alu I et migration sur gel d’agarose (1%). La taille des fragments est indiquée en paires de bases (pb). Digestion par Alu I CONCLUSION : Impossibilité de différencier les deux isolats 1OP et 1TRANS d’un point de vue taxonomique… DONC : = SOUCHES APPARTENANT AU MÊME GENRE BACTÉRIEN ? OU = TECHNIQUE INSUFFISAMMENT RÉSOLUTIVE ? 43ème congrès du GFP « Protection des cultures, Environnement, Santé et Bio-diversité : constats et perspectives »  29-31 Mai 2013

3- LES PROPRIETES BIOLOGIQUES DE L’ISOLAT: Caractéristiques génétiques Analyse des isolats bactériens par amplification des séquences REP (REP-PCR) M2 Profils identiques pour les deux isolats ! Profils REP-PCR des isolats 1OP et 1TRANS. Puits 1, 2, 5 et 6: REP PCR réalisée avec 1 ng.µL-1 d’ADN matrice. Puits 3, 4, 7 et 8: REP PCR réalisée avec 2 ng.µL-1 d’ADN matrice. CONCLUSION : Impossibilité de différencier les deux isolats 1OP et 1TRANS d’un point de vue taxonomique… DONC : À CE STADE, ces résultats suggèrent que les DEUX ISOLATS appartiennent très probablement au MÊME GENRE BACTÉRIEN et à la MÊME ESPÈCE … 43ème congrès du GFP « Protection des cultures, Environnement, Santé et Bio-diversité : constats et perspectives »  29-31 Mai 2013

3- LES PROPRIETES BIOLOGIQUES DE L’ISOLAT: Caractéristiques génétiques 2/ Séquençage et traitement des séquences d’ADNr 16S des isolats 1OP et 1TRANS 1OP et 1TRANS sont deux souches bactériennes qui appartiennent à la MÊME ESPÈCE ! = Pseudomonas putida Données en accord avec les résultats obtenus lors de la caractérisation TAXONOMIQUE. Nous avons proposé de nommer nos deux isolats respectifs : Pseudomonas sp. 1OP et Pseudomonas sp. 1TRANS SYSTÉMATIQUE : Bacteries, phylum des Proteobacteries, classe des  protéobactéries, ordre des Pseudomonadales, famille Pseudomonaceae, genre Pseudomonas. DÉPÔT DANS GENBANK des séquences d’ADNr 16S sous les numéros d’accession JF303892 et JF303891 pour Pseudomonas sp.1OP et Pseudomonas sp. 1TRANS respectivement. 43ème congrès du GFP « Protection des cultures, Environnement, Santé et Bio-diversité : constats et perspectives »  29-31 Mai 2013

3- LES PROPRIETES BIOLOGIQUES DE L’ISOLAT: Caractéristiques génétiques ARBRE PHYLOGÉNÉTIQUE : Analyse des ADNr 16S des isolats Pseudomonas sp. 1TRANS et Pseudomonas sp. 1OP. PHYLA Actinomycetales Gram(+) α-Protéobactéries β-Protéobactéries γ-Protéobactéries Atrazine !!! 43ème congrès du GFP « Protection des cultures, Environnement, Santé et Bio-diversité : constats et perspectives »  29-31 Mai 2013

3- LES PROPRIETES BIOLOGIQUES DE L’ISOLAT: Caractéristiques génétiques RÉSULTATS : Etude de la stabilité du phénotype sulcotrione-dégradant par essai de curage de plasmide sur l’isolat Pseudomonas sp.1OP - Perte du phénotype dégradant après 10 transferts consécutifs de la culture en milieu riche sans sulcotrione. = souche non curée = souche curée 43ème congrès du GFP « Protection des cultures, Environnement, Santé et Bio-diversité : constats et perspectives »  29-31 Mai 2013

3- LES PROPRIETES BIOLOGIQUES DE L’ISOLAT: Caractéristiques génétiques RÉSULTATS : Etude de la stabilité du phénotype sulcotrione-dégradant par essai de curage de plasmide sur l’isolat Pseudomonas sp.1OP = souche non curée = souche curée 43ème congrès du GFP « Protection des cultures, Environnement, Santé et Bio-diversité : constats et perspectives »  29-31 Mai 2013

3- LES PROPRIETES BIOLOGIQUES DE L’ISOLAT: Caractéristiques génétiques RÉSULTATS : Profil plasmidique de l’isolat Pseudomonas sp.1OP 1 3 2   12 kb 4 5 6 PLASMIDE CATABOLIQUE Pistes 1 et 6 : Marqueur de taille (kb). Pistes 2 et 3 : Isolat cultivé en milieu riche (TS broth) en absence de sulcotrione. Pistes 4 et 5 : Isolat cultivé en milieu minimum en présence de sulcotrione, 43ème congrès du GFP « Protection des cultures, Environnement, Santé et Bio-diversité : constats et perspectives »  29-31 Mai 2013

4- CONCLUSION ET PERSPECTIVES *Pseudomonas sp.1OP est la seule souche bactérienne du sol décrite à ce jour comme dégradant la sulcotrione (Bactérie GRAM -) *Spécificité relative de cet isolat *Rôle confirmé des éléments génétiques mobiles (plasmide catabolique) *Plasticité génétique du genre Pseudomonas confirmée et rôle majeur dans les biodégradations microbiennes des xénobiotiques = Modèle d’étude fondamental en Génomique Evolutive (cf Pseudomonas strain ADP pour l’atrazine) ? 43ème congrès du GFP « Protection des cultures, Environnement, Santé et Bio-diversité : constats et perspectives »  29-31 Mai 2013

5- CONCLUSION ET PERSPECTIVES *Isolement du plasmide catabolique *Séquençage et annotation *Essais de conjugaison chez souches Gram - compatibles (Inc) *Caractérisation de la voie catabolique *Essais de biodégradation sur d’autres herbicides tricétones de synthèse et/ou NATURELS avec l’isolat Pseudomonas sp.1OP 43ème congrès du GFP « Protection des cultures, Environnement, Santé et Bio-diversité : constats et perspectives »  29-31 Mai 2013

MERCI DE VOTRE ATTENTION 43ème congrès du GFP « Protection des cultures, Environnement, Santé et Bio-diversité : constats et perspectives »  29-31 Mai 2013