Optimisation de l’embryogenèse somatique du palmier dattier (Phoenix dactylifera L.) par passage en milieux liquides agités(1) A. OTHMANI*, Ch. BAYOUDH*, J. HEDFI***, H. SOUIDI*, N. DRIRA**, M. TRIFI*** et M. MARRAKCHI *** (*): Laboratoire de Culture de Tissus de Palmier Dattier - Centre de Recherches Phoenicicoles de l’INRAT– 2260 Degache- Tunisie (**) : Laboratoire de Physiologie et de Biotechnologie Végétale - Faculté des Sciences à Sfax- Tunisie. (***): Laboratoire de Génétique et Biologie Moléculaire- Faculté des Sciences de Tunis- El Manar II- Tunisie. (1) Ce travail a été réalisé avec l’assistance du projet PNUD/FEM/IPGRI-RAB98G31 «Gestion Participative des Ressources Génétiques de Palmier Dattier dans les Oasis du Maghreb » (2001-2005) Résumé Un protocole d’optimisation de la régénération rapide des plants de palmier dattier de qualité, cultivars Deglet nour et Boufeggous, par embryogenèse somatique en milieux liquides agités a été mis en œuvre. La déshydratation des embryons structurés issus des milieux liquides agités a permis d’activer et d’améliorer leur capacité germinative. Effets de la déshydratation sur la capacité germinative des embryons Les embryons structurés obtenus à partir du milieu liquide agité présentent une hyperhydricité notable qui réduit sérieusement leur pouvoir germinatif (Fig. 1). La dessiccation partielle de ces embryons, conduisant à une baisse de leur teneur en eau améliore significativement leur capacité germinative grâce à l’augmentation des peroxydases, isoenzymes connues par leur implication dans plusieurs processus morphogénétiques. (Gaspar et al., 1991) Introduction Le palmier dattier (Phoenix dactylifera L.) occupe une place stratégique dans le développement oasien, non seulement par la production des dattes, mais aussi par ses rôles écologiques et socio-économiques inestimables (Rhouma, 1988). La multiplication des différents cultivars est assurée par la voie végétative au moyen des rejets produits à la base du stipe. Ce mode de propagation s’avère très limité en raison du nombre restreint des rejets formés et se révèle insuffisant vis à vis d’une demande croissante en plants de qualité. Ainsi, le recours à la culture in vitro, par ses différentes techniques constitue à nos jours les remèdes à ces problèmes. En effet, l’embryogenèse somatique est la technique adéquate susceptible de produire un grand nombre de plants de qualité permettant de palier les dégâts causés par la maladie des feuilles cassantes dont l’agent causal est encore inconnu et celle de bayoud causée par le Fusarium oxysporum f.sp albedenis (Sedra, 1994). L’objectif de ce travail est d’optimiser le protocole d’obtention des tissus embryogènes utiles à la régénération d’innombrables embryons de cultivars de valeurs dans un temps très court après passage en milieu liquide agité. Photo 1: Cal embryogène de palmier dattier issu de milieu solide Afin d’améliorer la capacité germinative des tissus embryogènes et de raccourcir le temps de germination, on a recours à une étape de culture en milieu liquide agité. Différents stades ont été observés: stade globulaire (St 1), stade post-globulaire (St 2), stade embryon différencié (St 3) et stade embryon structuré (St 4). (photo 2) Conclusion Le tissu embryogène obtenu en milieu solide montre des difficultés dans sa germination. L’introduction d’une étape en milieu liquide agité constitue un progrès important permettant l’augmentation du nombre des embryons structurés, l’amélioration de leur taux de germination ainsi que le raccourcissement du temps de leur différenciation. Le taux d’embryons structurés obtenu à partir du milieu liquide agité est influencé par plusieurs facteurs : la dose en 2,4-D et en charbon actif. la dose et la nature des éléments minéraux La dessiccation des embryons somatiques est un traitement très efficace permettant d’atteindre des taux de germination élevés (90 %). Le présent travail ouvre des voies sur la production des semences artificielles. Toutefois, des risques de variations somaclonales peuvent être obtenus suite à l’emploi de 2,4-D, souvent connu par son activité mutagène. St 1 St 2 Matériel et méthodes Matériel végétal. Les expériences ont été réalisées sur 2 cultivars de palmier dattier: Deglet nour et Boufeggous. Les souches ont été établies en culture in vitro au laboratoire selon Drira (1983). Formation des cals embryogènes L’initiation des cals embryogènes a été obtenue en cultivant sur milieu de Murashige et Skoog (1962) additionné de charbon actif, 1 g/l; de 2,4-D, 10 mg/l; du saccharose, 40 g/l et de l’Agar, 7 g/l des explants provenant des bourgeons axillaires et des folioles. Établissements des cultures en suspension Les cals obtenus sont transférés après hachage en milieu liquide agité. Le milieu est celui de MS1/2 avec charbon actif, 0.3 g/l; saccharose, 30 g/l et 2,4-D, 0 à 2 mg/l. Les cultures sont incubées sur un agitateur rotatif (100 trs/min). Régénération des plantules Après 10 semaines de mise en culture en milieu liquide agité, des embryons structurés ont été obtenus. Ils ont été l’objet d’un test de l’effet de la déshydratation sur leur capacité de germination. St 3 St 4 Photo 2: Différents stades d’évolution des tissus embryogènes Effets de la dose hormonale en 2,4-D sur la structuration des embryons. L’initiation de la maturation des tissus embryogènes en milieu liquide agité durant 8 semaines est possible en utilisant différentes doses de 2,4-D allant de 0 à 2 mg/l. Le suivi des cultures montre que les taux de germination des embryons est influencé par la concentration hormonale en 2,4-D (tableau 1) Tableau 1: Effets de la concentration en 2,4-D sur la structuration des embryons. Références bibliographiques Daguin F 1988- Régénération du palmier dattier (Phoenix dactylifera L.) par embryogenèse somatique: amélioration de l’efficacité par passage en milieu liquide agité. Fruits 43;3: 191-194. Drira N 1983- Multiplication végétative du palmier dattier (Phoenix dactylifera L.) par culture in vitro de bourgeons axillaires et de feuilles qui en dérivent. C R Acad Sc Paris, SerIII 296: 1077-1082. Feki L, Bahloul M, Masmoudi R et Drira N 2003- Étude des capacités germinatives des embryons somatiques chez le palmier dattier: Dessiccation, corrélations morphogénétiques et investigations biochimiques. Plant Cell Report. 17 pp. Gaspar T, Penel C, Hagege D et Greppin H 1991- Peroxydases in plant growth, differenciation and development process. In Biochemical, Molecular, and Physiological Aspects of Plant Peroxydases. J Lobarzewski, H Greppin, O renel, Tn Gaspar eds.Univ. Of Genève, Switzerland, 249-280. Rhouma A 1998- La recherche scientifique agricole au service du palmier dattier. Rev Agr 21: 31-34. Variété Deglet nour Boufeggous Tau de 2,4-D (mg/l) 0.5 1 1.5 2 Taux d’embryons structurés (%) 60 70 90 75 50 45 65 Résultats et discussions Obtention des tissus embryogènes Les tissus de palmier dattier, sur le milieu de callogenèse à forte teneur en auxines, continuent à former des organes différenciés. Après 7 subcultures (Deglet nour) ou plus (Boufeggous), le cal devient blanchâtre et montre des structures granulaires de plus en plus fines et nombreuses (Photo 1). Le passage en milieu liquide agité assure l’individualisation de la grande partie des tissus embryogènes des 2 variétés Deglet nour et Boufeggous et permet d’obtenir une maturation du matériel embryonnaire satisfaisante en vue des étapes ultérieures de régénération. Toutefois, pour la variété Deglet nour, le taux optimal d’embryons structurés est de 90% avec la dose de 1 mg de 2,4-D alors que celui de Boufeggous es de 70 % avec la dose de 0.5 mg de 2,4-D. Cette différence dans le taux d’embryons structurés est due à des nécroses qui affectent les embryons de la variété Boufeggous.