Taxonomie = Systématique: science qui étudie la diversité des êtres vivants ainsi que les relations qui existent entre eux. Elle recouvre 3 domaines différents: la classification, la nomenclature et l’identification.

Elle consiste à:  Caractériser les bactéries,  Les classer sur la base de leur similitude, en groupes ou taxons (genres, espèces)  Appliquer le code international de la nomenclature bactérienne pour les nommer (Exp: Escherichia coli,)  Identifier de nouveaux organismes et déterminer leur appartenance ou non à l’une des espèces connues.

Procaryotes Domaine Bacteria Archaea Phylum Firmicutes Actinobacteria Règne Procaryotes Domaine Bacteria Archaea Phylum Firmicutes Actinobacteria Euryarchaeota Classe Bacilli Clostridia Methanomicrobia Sous-classe Actinobacteridae Ordre Lactobacillales Bacillales Clostridiales Actinomycetales Methanosarcina-les Sous-ordre Micrococcineae Famille Enterococca- ceae Staphylococca- Clostridiaceae Micrococcaceae Methanosaeta-ceae Genre Enterococcus Staphylococcus Clostridium Micrococcus Methanosaeta Espèce avium durans faecalis faecium gallinarum solitarius aureus acetobutylicum aerotolerans bifermentans botulinum perfringens mucilaginosis concilii harundinacea Methanothrix thermophila

Principe:  Tout individu appartient à une espèce,  Les espèces proches sont groupées en un genre  Les genres rapprochés sont réunis en une famille,  Les familles présentant des similitudes forment un ordre  Les ordres apparentés sont rangés en une classe,  Les classes semblables sont réunies en une division ou phylum

Phylum CLASSE ORDRE « ales » FAMILLE « aceae » GENRE « us», « er », « a » ESPECES SOUCHES BIOTYPES LYSOTYPES PATHOTYPES GENOTYPES TOXOTYPES SEROTYPES

TP1: La famille des Enterobacteriacae : IDENTIFICATION BIOCHIMIQUE

GENERALITES On définit classiquement les entérobactéries par 7 critères: -Bacilles Gram- de dimension moyenne -Non exigeants (culture facile) -Oxydase négative. Nitrate réductase + (capables de réduire les nitrates en nitrites) -Aéro-anaérobies facultatifs(capables de pousser en présence ou en absence de dioxygène) -Voie fermentaire de dégradation du glucose (avec ou sans production de gaz) -Immobiles ou mobiles par ciliature péritriche -Non sporulés

I- Etude du Métabolisme Energétique 1-Etude du type respiratoire Incubation 24 h à 37°C Milieu VF avant utilisation Résultat A- Si elle pousse le long du tube => Bactérie aérobie anaérobie facultative B- Si la bactérie pousse à la surface du tube => Bactérie aérobie stricte C- Si la bactérie pousse dans une zone intermédiaire => Bactérie micro aérophile D- Si la bactérie pousse au fond du tube => Bactérie anaérobie stricte

- Technique de recherche de l’Oxydase N-N dimethyl-paraphénylène diamine Pipette Pasteur Aucune Tache  Oxydase - Tache violette  Oxydase +

II- Etude du métabolisme glucidique: Voies d’attaques des Glucides Etude effectué sur milieu Hugh et Leifson : milieu semi liquide contenant un indicateur de PH : le Bleu de bromothymol ou le rouge de phénol. -Les bactéries peuvent utilisées le Glucose selon 2 voies: Voie Fermentative : la Réaction se déroulent en absence d’oxygène provoquant une baisse de pH du milieu suite à la formation d’acide Voie Oxydative: l’oxygène de l’air est obligatoirement utilisé , donc il y a peu d’acide formé et l’acidification aura lieu uniquement à la surface

- Technique  Germe inactif vis à vis du Glucose Aucun virage dans les 2 tubes  Germe inactif vis à vis du Glucose Le milieu reste tel qu’il était avant ensemencement. Il n’y a pas de culture. Les bactéries sont inertes vis-à-vis du glucose - Technique Virage au jaune débutant dans le tube ouvert Virage de l’indicateur de pH au jaune dans la partie supérieure du tube. Le milieu est devenu acide. Il y a utilisation du glucose par les bactéries en présence d’ O2. Les bactéries sont oxydatives vis-à-vis du glucose. Incubation 48h à 37°C Ouvert Milieu Hugh et Leifson + Glucose Ensemencement Virage de l’indicateur de pH au jaune dans tout le tube. Le milieu est devenu acide. Il y a eu production d’acides lors de l’utilisation du glucose par les bactéries en présence et en absence d’O2. Les bactéries sont fermentatives vis-à-vis du glucose. Virage au jaune dans les 2 tubes Fermé: (+ Huile de paraffine)

Stade Azote : Stade Gazeux 3- Recherche de la Nitrate réductase : Bouillon Nitrate (NO 3 - ) NO 3 - + 2H + + 2 e - NO2-+ H2 0 Nitrate Réductase Stade Nitrite NO 3- + 6 H + + 5 e - ½ N2 + 3 H2 O Nitrite Réductase Stade Azote : Stade Gazeux Technique Virage au Rouge Stade Nitrite => Nitrate Réductase + Ensemencement 24h à 37°C Nit1 +Nit2 Virage au Rouge  Nitrate Réductase - Bouillon Nitrate (NO 3 -) Ajout de Zinc Pas de virage : Stade Azote  Nitrate Réductase + Ex: Pseudomonas

Le Zn a la propriété de réduire les nitrates en nitrite. Cet ajout va répondre à deux interrogations : premier cas : la bactérie ne possède pas la nitrate réductase. L'ajout de Zn va réduire les nitrates en nitrites qui vont réagir avec les réactifs de Griess (Nit1 et Nit2) - deuxième cas : la bactérie possède une nitrate réductase très active qui a réduit les nitrates jusqu'au stade azote moléculaire N2(=diazote). Dans ce cas l'ajout de Zn ne provoquera pas la réduction des nitrates car il n'en reste plus dans le milieu.

Milieu Urée Indole  Uréase -  Uréase + 4- Recherche de l’Uréase, Tryptophanase et Tryptophane désaminase (TDA): Milieu Urée Indole Recherche de l’Uréase Coloration orange jaune : pas d’hydrolyse de l’Urée  Uréase - Ensemencement Incubation 24h à 37°C Coloration Rouge : hydrolyse de l’Urée  Uréase + Milieu Urée Indole

TDA  TDA- - Recherche de la Tryptophane Désaminase: TDA Tryptophane + H2O Acide Indole pyruvique TDA Quelques gouttes de chlorure de Fer III Urée Indole Si précipité marron: la bactérie a dégradé la tryptophane avec la tryptophane désaminase  TDA + Absence de précipité : La bactérie n'a pas dégradé la tryptophane avec la TDA  TDA-

- Recherche de la Tryptophanase Tryptophane + H2O Indole + Acide 2 –céto-propanoique + Acide Ammoniac pyruvique Réactif de Kovacs -Présence d’un anneau Rouge : Indole + -Absence d’un anneau Rouge : Indole -

V- Métabolisme du Lactose: Milieu Kligler–Hajna Ensemencement 1) Piqûre centrale dans le culot Fil droit ou pipette boutonnée 2) Stries serrées sur la pente Öse ou pipette boutonnée Milieu rouge qui permet de dégager 4 caractères: L’utilisation du Lactose L’utilisation du Glucose La production de H2S La production de Gaz 1- La lecture du lactose au niveau de la pente: Si virage vers le jaune => la bactérie possèdent la βgalactosidase Lac + Si pente rouge : Bactérie ne possède pas de β Galactosidase  Lact - 2- la lecture du Glucose au niveau du culot : Si culot rouge  Bactérie Glucose – Si culot Jaune  Bactérie Glucose + 3- Production de H2S à partir du thiosulfate du milieu H2S + Fe III précipité noir ( Sulfure de Fer) => H2S + 4- Production de Gaz : Si il y a présence de bulles ou bien décollement du gélose  Gaz + Sinon  Gaz -

ONPG ?? - Lecture du milieu Kligler Hajna Exemple Lactose - + Glucose H2S Gaz ONPG ??

(substrat artificielle) - Test à l’ONPG (Ortho Nitro Phényl β Galactoside) La dégradation du lactose par les micro-organismes passe par sa transformation en glucose. Elle n’est possible que s’il y si ces micro-organismes posédent : La β Galactosidase perméase La β Galactosidase β Galactosidase Lactose + H2O Glucose + Galactose Absence de β Galactosidase  Bactérie Lac – (vrai) Si la Bactérie Glu + , Lac - Présence de β Galactosidase + β Galactoside perméase membranaire défectueuse ONPG (substrat artificielle)

Milieu d'ONPG : Ce test permet de rechercher la présence d'une enzyme intracellulaire ß-galactosidase (ONPG hydrolase) qui permet l'hydrolyse du lactose en glucose et galactose. Une bactérie lactose- peut l’être pour 2 raisons : - Absence de ß-galactosidase. -  Absence de ß-galactoside perméase Le test ONPG permet de recherche directement la présence de ß-galactosidase en fournissant à la bactérie un substrat de cette enzyme : L'orthonitrophényl- â-D-galactopyranoside.

Recherche de la -galactosidase 2) Ajouter stérilement un disque ONPG 1) Faire une suspension épaisse à partir de colonies prélevées sur la pente Elle s’effectue sur un tube de Kligler LAC - 3) Incuber à 37°C pendant 30 minutes 1) Le tube reste incolore.  absence de la -galactosidase : ONPG - 2) La suspension est colorée en jaune  présence de la -galactosidase : ONPG +, mais absence de la perméase.

Milieu Citrate de Simmons Ce milieu permet de mettre en évidence l'utilisation du citrate comme seule source de carbone et d'énergie. Ce caractère est intéressant pour discriminer les bactérie entre-elles et ainsi de les identifier.

Milieu Mannitol - mobilité - nitrate  Caractères lus sur MMN (Mannitol-Mobilité-Nitrate) : deux caractères sont lus directement : l'utilisation du mannitol et la mobilité de la bactérie. un caractère est lu indirectement après ajout des réactifs

VI- Identification Biochimique des Bactéries :Galerie API 20E 1- Présentation de la galerie Galerie de 20 microtubes prêts à l’emploi permettant de réaliser 23 tests biochimiques afin d’identifier des bacilles Gram – appartenant à la famille des ENTEROBACTERIACEAE. cupule microtube contenant le milieu déshydraté La suspension bactérienne introduite dans le tube dissout les substrats déshydratés

2- Préparation de l’inoculum 1 seule colonie Prélèvement d’une souche pure isolement 5 mL d’ED stérile Suspension d’opacité 0,5 sur l’échelle de Mac Farland

3- Ensemencement de la galerie API 20 E Introduire la suspension bactérienne dans chaque tube à l’aide d’une pipette Pasteur stérile, pointe appuyée à l’intérieur et sur le côté pour éviter la formation de bulles Pour certains caractères: Remplir le tube de suspension et recouvrir d’huile de paraffine ADH, LDC, ODC, H2S, URE Remplir de suspension le tube et la cupule CIT, VP, GEL

Les 10 premiers tests Tests négatifs Tests positifs

Les 10 derniers tests Tests négatifs Tests positifs

5- Identification de la souche Résultats de la galerie: - + + + + 5 2 1 5 7 7 3 5 5 Résultats reportés sur la fiche d’identification Code n°: 5 215 773 (55) Se référer au catalogue pour identifier la souche à l’aide du code