La République Algérienne Démocratique et Populaire Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique Université de Ghardaïa Travail de faire :  Sebrou Imane  Houari Nadia Année scolaire: Groupe: 02 Dirigé par : Mr. Djellid L’extraction & purification des acide nucléiques

Plan de travail : 1.Introduction 2.Classification 3.Le principe de protocoles : 1.Lyse cellulaire 2.Elimination des protéines et des lipides 3.L’inactivation des nucléases cellulaires 4.Elimination des autres acides nucléiques : 4.1. purification de l’ADN 4.2. Purification des ARN 4.3. Minipréparation des plasmides 4. Purification par centrifugation isopycnique sur chlorure de césium 5. Purification par chromatographie 6. Conservation des acides nucléiques 7. Conclusion

1. Introduction : L’extraction et la purification des AN sont les premières étapes dans la plupart des études de biologie moléculaire. L'AN ainsi extrait peut ensuite être utilisé pour le séquençage, la PCR ou le clonage..

2. Classification : Le choix de la technique la plus adéquate repose généralement sur:  L’acide nucléique cible.  L’organisme source.  Le matériel de départ.  •Les résultats escomptés (rendement, pureté..)  L’application en aval (PCR, clonage..)

1) L’extraction Lyse mécanique Lyse chimique Choc thermique Choc osmotique Ultra-sons Homogéneisat. à haute pression eucaryote ProcaryoteProcaryote: La paroi est un obstacle majeur ProcaryoteProcaryote: La paroi est un obstacle majeur Des hydrolases spécifiques Pression osmotique Détergents :  SDS  Triton X100  Sarcosyl

2) Elimination des protéines Hydrolyse enzymatique Précipitation par un agent chaotropique (déprotéinisation par défécation )  Endoprotéase non spécifique : la protéinase K (65°c) + SDS Précipitation dénaturants  NaCl et (NH 4 ) 2 SO 4  NaClO4  LiCl  TCG  NaI

A la fin de l’extraction on est en présence d’un débris qui est débrasé par centrifugation, on obtient alors un « extrait brut». Après centrifugation, il reste peu de protéines dans le surnageant > Réactifs divers ajoutés : 1) les agents chaotropiques :Thiols, NaCl 0,15 M qui empêche la séparation des deux brins. 2) Le citrate de sodium et l’acétate de sodium > stabiliser l’ADN aussi.

3) L’inactivation des nucléases cellulaires : une substance chélatrice telle l’EDTA ou le citrate > magnésium (cofacteur des DNases et RNases). 4) Elimination des autres acides nucléiques : 4.1 Purification de l’ADN : NaOH : l’ARN est hydrolysé. « DNase free » Par élimination des ARN

4.1.2 par extraction phénol-chloroforme : 1. l'extraction phénolique : le phénol est un déprotéinisant puissant.. 2. l'extraction au chloroforme : complète l'extraction pour éliminer toutes traces de phénol aqueux. Le chloroforme est additionné d’AIA qui est un agent antimousse stabilisant la séparation des phases. l’élimination de l’ARN peut être effectué avant ou après, où doit être suivi d’une 2ème déprotéinisation afin d’éliminer la RNase résiduelle..

4.2 Purification des ARN : 1) par inhibition des RNases : DEPC, est un composé organique, réagir spécifiquement avec les his. + ~ tyr. Les RNases sont très résistantes aux agents dénaturants > DEPC modifie les histidines du site actif. 2) Par extraction phénol acide-chloroforme : Une extraction en phénol acide (pH 5). Dans ces conditions les histones, vont alors s’associer plus fortement à l’ADN génomique.

3. Minipréparation de plasmides : l'ADN dénature (les 2 brins séparés) Lyse des Cellules +SDS+soude +Ph 13 Neutralise rapidement par acetate de K (ph 5) Renaturation brutale ADN Chr. :Long (10 6 pd) ADN plasmidique: court(10 3 pd) Ne parvient pas à se réapparier + enchevêtrement insoluble Reforme + reste en solution lysat clair Les sépare par centrifugation

4. Purification par centrifugation isopycnique sur chlorure de césium  Cette technique permet de distinguer l’ADN natif (double brin) de l’ADN dénaturé (simple brin) et de l’ARN.  En effet, il ya des liaisons possibles entre des grpt ionisés de l’intérieur d’ADN et le chlorure de césium qui est lui aussi chargé (Cs+).  l’ADN dénaturé ou l’ARN seront plus denses que l’ADN natif.  Lors de l’extraction des acides nucléiques, le chromosome très grand est « cassé » et les fragments linéaires prennent une forme relâchée.

 D. ARN > D. ADN l’ARN précipite au culot Pour le purifier, lavage par acétate de Na + précipite à l’alcool  Pour la maxipréparation, en présence de bromure d’éthidium (BET) saturant. Lysat clair soumise à une ultracentrifugation

5. Purification par chromatographie : 1) La chromatographie d’adsorption sur colonne de silice : A.Des billes paramagnétiques recouvertes de silice et la séparation sera effectuée à l’aide d’un dispositif aimanté. B. Le gel de silice est un polymère d'acide silicique Si(OH)4.  L’agent chaotropique intervient comme compétiteur dans les relations que l’ADN établit avec l’eau.  La colonne est lavé par de l’éthanol.

 L’ADN est élué par un tampon à  sel  ou de l’eau pure, il va à nouveau établir des liaisons avec l’eau, s’hydrater et repasser en solution. 2)La chromatographie sur colonne échangeuse d’anions :  Un échangeur d'anions de type DEAE cellulose : c’est un échangeur faible> sous forme ionisée ou neutre.  Un échangeur d’anions de type Q-sepharose (R4N+) : c’est un échangeur fort > tout le temps ionisé.

 homogénat +  sel  : L’ADN se fixe à la colonne. L’ADN est finalement élué à l’aide d’un tampon à haute force ionique. Afin d’éliminer les sels, l’ADN est précipité par l’alcool. 3) La purification des ARN m euc. par chromatographie d’affinité : La plupart des ARNm euc. possèdent une queue poly(A) en 3’. La purification se fait par passage sur une colonne oligo(dT) : oligo(dT) cellulose ou oligo(dT) fixé à des billes magnétiques.

6. Conservation des AN : 1) d’ADN :  Un tampon (10mM de pH=8), à 4°c.  Additionné d'EDTA 1mM qu’ils évitent aussi la croissance de microorganismes.  Il peut être conservée également au réfrigérateur/2 sem. ou au congélateur à -20 °c/des périodes plus longues. 2) d’ARN : Du fait de l’ARN plus instable que l’ADN à cause des RNases, les échantillons sont stockés à -80°C après addition d'éthanol.

7. Conclusion : Il existe aujourd'hui un grand nombre de kits commerciaux qui réalisent rapidement l’extraction et la purification, de faibles couts, proposent améliorations des méthodes décrites précédemment de côtes de sécurité du manipulateur, mais de moins pureté de l’extrait par rapport d’haut, contiennent souvent des petites colonnes de résine chromatographique échangeuse d'anions ou de silice.