CHAPITRE I Généralités

I. Anatomie pathologique et pratique médicale

L'Anatomie Pathologique est l'étude des modifications morphologiques des organes au cours des processus pathologiques. Elle repose sur l'analyse des cellules et des tissus par diverses méthodes, principalement basées sur la morphologie. Elle a un but diagnostique. Elle permet l'appréciation du pronostic, l'évaluation du résultat des traitements et une meilleure compréhension des causes et des mécanismes des maladies.

La démarche de l'anatomie pathologique est basée sur une analyse sémiologique dont l'interprétation repose sur un raisonnement analogique. Cette analyse compare la morphologie des tissus normaux et des tissus pathologiques. La différence d'aspect entre le Normal et le Pathologique s'appelle une lésion. La lésion est donc une altération morphologique (cause ou conséquence d'un processus morbide) décelable par un moyen d'observation quelconque (macroscopique, microscopique). Cette définition exclut les modifications fonctionnelles de l'état normal. Une lésion élémentaire est une unité lésionnelle correspondant à l'altération morphologique d'une structure considérée isolément.

L'association des lésions élémentaires réalise un ensemble lésionnel ou groupement lésionnel qui permet de formuler un diagnostic. Ces lésions anatomo-pathologiques sont confrontées aux données cliniques : c'est la corrélation anatomo-clinique. Le dialogue avec les cliniciens est indispensable pour permettre une interprétation synthétique qui aboutit soit à un diagnostic de certitude, soit à un diagnostic probable, soit à un diagnostic incertain. Le compte-rendu anatomo-pathologique décrit les différentes lésions et la conclusion affirme un diagnostic ou propose une hypothèse diagnostique orientée par les données cliniques. Dans certains cas, le compte-rendu anatomo-pathologique peut fournir des indications sur la potentialité évolutive des lésions et permettre d'orienter le pronostic par la connaissance de cas semblables antérieurs et de leur évolution.

Les grandes familles lésionnelles sont : le processus inflammatoire, les perturbations circulatoires, les troubles métaboliques, le processus tumoral et les anomalies congénitales. Comprendre les causes et les mécanismes des lésions observées est le but de la recherche médicale appliquée. Ainsi, l'anatomie pathologique constitue un carrefour interactif entre la clinique, la biologie médicale et l'imagerie tant pour le diagnostic des maladies que pour faire progresser les connaissances médicales...

II. Place diagnostique (histopathologie et cytopathologie)

A. Démarche diagnostique Celle-ci suit les mêmes étapes que la démarche clinique. Les renseignements cliniques tiennent lieu d'interrogatoire, la sémiologie des lésions cellulaires et tissulaires est l'équivalent des signes cliniques. L'anatomo-pathologiste doit intégrer l'ensemble des faits morphologiques observés et des renseignements cliniques en un groupement lésionnel connu permettant un diagnostic.

B. Matériel d'étude 1. Prélèvements cellulaires : étude cytopathologique Le recueil de cellules isolées peut constituer : un examen de dépistage, fait de façon systématique, en l'absence de symptômes, dans une population particulièrement susceptible d'être atteinte d'une affection (tumorale surtout)... cf. chapitre XV; un examen diagnostique; une méthode de suivi post-thérapeutique.

Il est réalisé : par raclage (frottis) d'une muqueuse (col utérin, vagin) ou de la peau; par ponction d'un liquide normal ou pathologique (liquide céphalorachidien, sang, ascite, liquide pleural...) examiné après cytocentrifugation; par recueil d'un produit de sécrétion, urines, lavage bronchiolo-alvéolaire… examiné après cytocentrifugation; par cytoponction à l'aiguille fine, d'un organe plein ou d'un kyste, parfois de façon dirigée, sous échographie ou scanner; par apposition sur lame d'un fragment tissulaire avant sa fixation.

Liquide pleural après centrigugation: présence de cellules épithéliales malignes provenant d’un adénocarcinome pulmonaire par envahissement direct.

Cellules mésothéliales malignes (mésothéliome malin)au cytoplasme spiculé dans un liquide pleural. A noter l’augmentation du rapport nucléo cytoplasmique, la présence de nucleole et l’hyperchromatisme nucléaire.

Cytologie par apposition d’un ganglion dans le cadre d’une sarcoïdose ganglionnaire. Présence de cellules épithéloïdes (CE) qui sont des cellules de grandes tailles aux noyaux volumineux faiblement basophile accompagné de nombreux lymphocytes normaux.

2. Prélèvements tissulaires : étude histopathologique La biopsie est le prélèvement d'un fragment de tissu chez un être vivant. Elle permet l'examen d'une partie (biopsie partielle) ou de la totalité (biopsie exérèse) d'une lésion. Elle est faite : sous contrôle de la vue, au bistouri ou avec diverses pinces, en surface ou au cours des endoscopies (gastrique, bronchique, colique; cœlioscopie...); à l'aiguille (ponction-biopsie) dans les organes profonds ; elle peut alors être dirigée, sous échographie ou scanner. Elle est souvent couplée à un recueil de cellules pour examen cytologique (cf. paragraphe précédent).

La pièce opératoire est le résultat d'un acte chirurgical avec résection d'un ou plusieurs organes. Son étude comporte un bilan macroscopique des lésions (nombre, siège, aspect), qui peuvent faire l'objet de photographies macroscopiques, et la réalisation des prélèvements nécessaires à l'examen microscopique. L'examen extemporané est une technique rapide qui permet, au cours d'une intervention chirurgicale, de donner un résultat histologique en moins de 20 minutes. Il s'effectue par congélation d'un fragment tissulaire, coupe et coloration simplifiée. Il est moins précis que la technique histopathologique standard, qui doit toujours le compléter, après le délai habituel de fixation et la procédure de routine. Il est indiqué lorsque son résultat peut modifier l'acte chirurgical (état des limites d'exérèse d'une tumeur, recherche d'une infiltration tumorale métastatique notamment ganglionnaire, nature d'une lésion découverte lors de l'intervention...).

L'autopsie (ou nécropsie) est un examen fait chez un patient décédé (à la demande des médecins et de la famille) pour préciser les lésions responsables des symptômes observés, établir les causes médicales immédiates de la mort et juger éventuellement de l'effet des traitements appliqués. L'autopsie médico-légale est réalisée par un médecin légiste à la requête de l'autorité judiciaire. Les prélèvements animaux peuvent être l'objet d'une étude anatomo-pathologique, en médecine vétérinaire ou au cours d'une expérimentation.

C. Méthodes d'étude 1. Etude cytologique La fixation des cellules étalées sur lames est fait : par séchage à l'air (comme en technique hématologique); par vaporisation d'un spray; par immersion dans un fixateur liquide (alcool + éther). La fixation immédiate, au moment du prélèvement, est indispensable pour préserver les cellules dont seule une bonne conservation permet l'étude cytologique ultérieure. La coloration des lames se fait : par la technique de May-Grunwald-Giemsa (MGG) utilisée en hématologie; par diverses associations de colorants nucléaires et cytoplasmiques (Papanicolaou, Harris-Shorr); éventuellement par des colorations particulières dérivées des techniques histochimiques utilisées en histopathologie, comme par exemple, le PAS, coloration de Gram, de Ziehl, argentation de Grocott,... (à la recherche d'agents pathogènes) ou par des techniques immunohistochimiques utilisant des anticorps marqués.

Présence de pneumocystis carinii colorés en noir par la coloration de Grocott dans un lavage broncho-alvéolaire.

Cytologie: Coloration de May Grunwald Giemsa (MGG) Cytologie: Coloration de May Grunwald Giemsa (MGG). Aspergillose pulmonaire-Filaments septés de diamètre régulier

2. Etude macroscopique des pièces opératoires et nécropsiques C'est un temps très important de l'examen anatomopathologique qui peut, à lui seul, orienter vers un diagnostic. L'examen à l'œil nu des modifications tissulaires et viscérales (dimensions, poids, couleur, forme, consistance,...) nécessite une bonne connaissance de l'anatomie et se fait en corrélation avec les renseignements cliniques. Il permet de juger de l'extension des lésions et des éventuels effets des thérapeutiques (par exemple nécrose secondaire à une chimio ou radiothérapie). Il peut être complété par d'autres techniques : colorations macroscopiques, photographies, radiographies, injections vasculaires,...

Avant fixation des tissus, peuvent être faits : Il permet, en vue de l'examen microscopique, d'effectuer des prélèvements tissulaires orientés, adaptés aux problèmes diagnostiques envisagés. Avant fixation des tissus, peuvent être faits : des appositions sur lames permettant une étude cytopathologique; des prélèvements pour des techniques particulières : congélation, fixation adaptée à la microscopie électronique, mise en culture cellulaire, cytogénétique,...

Macroscopie: étude opératoire d’une pièce de colectomie Macroscopie: étude opératoire d’une pièce de colectomie. Pièce non fixée. Colon © et mésocolon (MC)

Aspect après fixation formolée de 24h Aspect après fixation formolée de 24h. La pièce a été épinglée sur un liège.

Pièce ouverte transversalement

La tranche de section interessant la lésion est séparée en 3 fragments inclus dans une cassette

3. Etude en microscopie optique L'examen au microscope optique est indispensable avant toute autre technique plus compliquée. Il n'est réalisable qu'après plusieurs étapes : La fixation permet la conservation morphologique des structures tissulaires et cellulaires. Les fixateurs les plus utilisés sont le formol et le liquide de Bouin (mélange picro-formolé). Quel que soit le fixateur utilisé, la fixation doit être précoce, dans un volume de fixateur suffisant (au moins 10 fois le volume de la pièce), dans un récipient assez grand pour ne pas déformer le prélèvement. Les organes creux sont préalablement ouverts et lavés, les organes pleins volumineux peuvent être coupés en tranches. L'inclusion en paraffine nécessite une étape d'enrobage préalable par passage de chaque prélèvement dans une série de solvants organiques qui le déshydratent (et dissolvent les graisses figurées intra-tissulaires) et permettent l'imprégnation de la paraffine dans le tissu. Elle consiste à confectionner un bloc de paraffine pour chaque prélèvement en orientant convenablement le fragment dans le sens de la coupe.

Principe de la déhydratation d’un prélévement fixé

Inclusion en paraffine des prélèvements déshydratés Inclusion en paraffine des prélèvements déshydratés. La paraffine qui a été chauffée est liquide puis refroidie sur une plaque réfrigérée.

La coupe du bloc de paraffine au microtome permet de réaliser une coupe très fine de 3 à 5 microns d'épaisseur pour chaque prélèvement. Cette épaisseur permet aux rayons lumineux du microscope de traverser le prélèvement et d'éviter les superpositions cellulaires. La coupe est déposée et collée sur une lame en verre. De multiples coupes successives peuvent être faites dans un même bloc. La coloration permet de mettre en évidence spécifiquement les différentes structures tissulaires et cellulaires. La coloration usuelle associe toujours un colorant nucléaire (hématéine, hématoxyline) et un colorant cytoplasmique (éosine, érythrosine); il s'y ajoute souvent un colorant du tissu conjonctif (safran), ce qui réalise une coloration trichromique. L'examen au microscope se fait après montage de la préparation sous lamelle (ce qui permet la conservation ultérieure des lames).

Section au microtome du bloc d’inclusion. Obtention d’un ruban.

Etalement d’un fragment de ruban sur une lame

Coupes obtenues de la lésion

Coloration usuelle- Hématoxyline-éosine (H&E)- Noyaux en mauve car prenant le colorant basique à savoir hématoxyline (mauve) et cytoplasme en rose car prenant le colorant acide à savoir l’éosine (rose).

La durée minimale de la technique est de deux à trois jours, mais elle est en fait très variable selon : la taille des prélèvements : certaines pièces opératoires nécessitent 2 à 3 jours de fixation; la nature des prélèvements : nécessité de décalcification préalable des tissus osseux ou calcifiés; les colorations spéciales, nécessaires à de nombreux diagnostics, peuvent durer plusieurs jours. l'urgence de certains diagnostics, qui impose de raccourcir au maximum les différentes étapes des techniques.

Le safran qui est parfois ajouté à l’H&E permet de mettre en évidence les fibres de collagène dans le cadre d’une fibrose.

4. Techniques particulières Il peut s'agir de colorations spéciales, faites sur les coupes obtenues après inclusion en paraffine, mettant en évidence : le fer : coloration de Perls; les fibres de collagène : elles sont mises en évidence par les colorations trichromiques et, plus finement, par le rouge sirius; les fibres réticuliniques : argentation; les membranes basales : PAS (Acide périodique de Schiff); les fibres élastiques : orcéine; le glycogène : PAS; les mucines : PAS, bleu Alcian; les grains de sécrétion neuro-endocrines : argentation selon Grimélius;

la mélanine : argentation de Fontana; la substance amyloïde : rouge Congo, thioflavine examinée en lumière ultra-violette, violet de Paris, ... (chapitre IX); des agents infectieux : germes (coloration de Gram), bacille tuberculeux (coloration de Ziehl, auramine examinée en lumière ultra-violette), champignons (PAS, argentation de Grocott), virus de l'hépatite B (orcéine modifiée selon Shikata). La coloration par le bleu de toluidine est utilisée sur les coupes des examens extemporanés et sur les coupes semi-fines (inclusions en résine pour la microscopie électronique). On utilise également les examens en lumière polarisée (mise en évidence de corps étrangers biréfringents, biréfringence de l'amylose et en lumière ultraviolette.

Coloration de Perls: Mise en évidence du fer qui est coloré en bleu dans le cadre d’une hémochromatose hépatique

Cirrhose hépatique- Coloration au trichrome de Masson- Fibrose colorée en bleu séparant les nodules de regénération.

Sarcoïdose hépatique: multiple granulomes en voie de fibrose Sarcoïdose hépatique: multiple granulomes en voie de fibrose. Les fibres de collagène en bleu entourant les granulomes et dissociant les cellules.

Foie normal: Coloration de trichrome de Masson Foie normal: Coloration de trichrome de Masson. Fibres collagéniques en vert.

Coloration de Sirius. Fibres collagéniques en rouge.

Coloration réticuline. Foie normal. Trame sinusoïdale en noir.

Coloration de PAS: peau normale- Membrane basale marquée.

Colration de Bleu Alcian. Colon normal Colration de Bleu Alcian. Colon normal. Mise en évidence des cellules caliciformes.

Argentation de Grimelius Argentation de Grimelius. Granulations brunes dans le cytoplasme des cellules neuroendocrines.

Argentation de Fontana. Peau normale Argentation de Fontana. Peau normale. Mélanocytes en noir dans les assises basales de l’épithélium.

Argentation de Fontana. Mélanomes.

Amyloïdose hépatique. Dépôts de substance amyloïde dans les parois artérielles d’un foie cirrhotique. Biréfrigence en lumière polarisée après coloration de rouge Congo.

Amyloïdose rénale. Coloration rouge brique dans un glomérule.

Coloration des BK par le Ziehl. Longs batonnets colorés en rouge.

Coloration de PAS- Aspergillose pulmonaire.

Coloration argentique de Grocott. Aspergillose en noir.

Corps étrangers. Biréfringence. H&E

Coupe en congélation d’un échantillon non fixé et déshydraté Coupe en congélation d’un échantillon non fixé et déshydraté. Embols de moelle osseus dans le poumon mis en évidence par la coloration de Oil Red.

Oil Red. Stéatose hépatique.

La recherche d'autres éléments peut nécessiter des techniques différentes : utilisation de fixateurs particuliers : AFA, glutaraldéhyde (ultrastructure); coupes à congélation : ce sont des coupes de tissus frais congelés réalisées sur un microtome refroidi à -20°C (cryostat). Après coupe et coloration, les lames sont directement observées (sans milieu de montage). Cette technique permet la réalisation d'examens extemporanés per-opératoires. En évitant la fixation du tissu et son inclusion en paraffine, elle peut aussi être utilisée pour : la mise en évidence des graisses (dont on a vu que les solvants nécessaires à l'inclusion en paraffine les font disparaître ; chapitre IX), l'étude histo-enzymologique (pathologie musculaire), la mise en évidence des dépôts extra-cellulaires d'immunoglobulines et de complément (biopsies rénale ou cutanée), certaines études immunohistochimiques et de biologie moléculaire (hybridation in situ, PCR) car la congélation des tissus permet de conserver l'intégrité des sites antigéniques et des acides nucléiques.

L’immunohistochimie permet l’identification “in situ”, sur coupe histologique, d’un antigène cellulaire ou tissulaire. Cette technique est basée sur une réaction spécifique antigène-anticorps utilisant des anticorps mono ou polyclonaux conjugués à une substance fluorescente ou à une enzyme qui réagit avec son substrat en donnant une coloration facile à voir au microscope optique en lumière blanche ou ultra-violette. Ces techniques sont effectuées sur coupes en paraffine ou à congélation (au cryostat, à partir de prélèvements frais, non fixés, congelés par immersion dans l'azote liquide).

L’intérêt de l’immunohistochimie est : diagnostique en facilitant l'identification et la classification des tumeurs grâce à des anticorps dirigés contre : des filaments intermédiaires : vimentine (cellules mésenchymateuses et sanguines), kératines (cellules épithéliales), neurofilaments (neurones), gliofilaments (cellules gliales), desmine (cellules musculaires striées), un type cellulaire : cellule lymphoïde (antigène pan leucocytaire), cellule endothéliale, cellule neuro-endocrine (chromogranine...), un antigène spécifique d'organe (prostatic specific antigen...), un agent infectieux (cytomégalovirus, herpèsvirus, papillomavirus, virus d'Ebstein Barr, pneumocystis Carinii, toxoplasme...), une sécrétion hormonale précise (thyroglobuline, gastrine, sérotonine, somatostatine, insuline, VIP...).

ATC anti cytokératine. Colon normal ATC anti cytokératine. Colon normal. Les cellules épithéliales sont positives.

ATC anti CD 45 (pan B et T). Colon normal ATC anti CD 45 (pan B et T). Colon normal . Mise e, évidençe des lymphocytes B et T.

ATC anti HSV

ATC fluorescent anti HBS- Hépatite B. Foie

pronostique : il existe des anticorps dirigés contre des protéines nucléaires exprimées lors de la prolifération cellulaire, permettant d’apprécier l’activité proliférative des tumeurs malignes; thérapeutique : des anticorps anti-récepteurs aux œstrogènes et à la progestérone permettent d’étudier le caractère hormono-sensible de certaines tumeurs malignes comme les cancers du sein.

La microscopie électronique se fait après fixation de très petits fragments (moins d'un mm) dans le glutaraldéhyde. Ses applications sont limitées à l'étude de certaines pathologies (maladies neuro-musculaires, pathologie rénale, tumeurs peu différenciées, certaines pathologies de surcharge…).

Inclusions virales mises en evidence par ME.