Cours de bactériologie Service de Bactériologie Département des Maladies infectieuses et parasitaires Faculté de Médecine Vétérinaire Cours de bactériologie 2ème doctorat Jacques Mainil Les souches entérohémorragiques d’Escherichia coli en médecine vétérinaire

Pathogenic strains of Escherichia coli Acronyms Pathotypes (or virulotypes) EHEC Enterohaemorrhagic E. coli EPEC Enteropathogenic E. coli DHEC Diarrhea-associated Haemolytic E. coli ExPEC Extraintestinal E. coli UPEC Uropathogenic E. coli NMEC Neonatal Meningitis E. coli APEC Avian Pathogenic E. coli ETEC Enterotoxigenic E. coli VTEC Verocytotoxigenic E. coli CDEC Cell Detaching E. coli CDTEC Cytolethal Distending E. coli NTEC Necrotoxigenic E. coli AEEC Attaching-Effacing E. coli EIEC Entero-invasive E. coli EAEC Enteroaggregative E. coli DAEC Diffusely-adherent E. coli

Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) EPEC, VTEC and EHEC Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) strains producing attaching/effacing lesions (AE) Verocytotoxigenic Escherichia coli (VTEC) strains producing only Shiga toxins (Stx) Enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC) strains producing Stx and AE lesion similar to O157:H7 E. coli causing haemorrhagic enterocolitis

Shiga toxins Production in the intestines Crossing of the epithelium through the enterocytes Reach the blood stream Active in vivo on the endothelial cells of the blood vessels Stop the protein synthesis in the target cells Oedemas and haemorrhages Attaching/Effacing lesion Attachment to the microvilli of the enterocytes Injection of bacterial effectors into the enterocytes Re- and dis-organization of the enterocyte cytoskeleton Effacement of the microvilli of the enterocytes Inflammatory reaction with cell infiltration, oedema of the mucosa and loosening of the tight junctions

- hommes Pathologies des EHEC - bovins Infection asymptomatique Entérocolite: diarrhée Entérocolite hémorragique: diarrhée abondante et hémorragique Syndrome hémolytique urémique Syndrome purpura thrombotique thrombocytopénique - bovins veaux (jusqu’à 3 mois): diarrhée adultes: portage asymptomatique - autres ruminants: portage asymptomatique - autres espèces : de manière anecdotique Rôle de toxines Stx dans les pathologies d’EHEC commencer par décrire les pathologies associées 5 [page]/[total pages] 5

Pathologies des EHEC 6 Rôle de toxines Stx dans les pathologies d’EHEC commencer par décrire les pathologies associées 6 [page]/[total pages] 6

? ? Epidemiology of EHEC EHEC ? young calves adult ruminants humans

Epidemiology of EHEC Ruminants Humans Meat, milk Direct contacts Intestinal content, faeces Dung, manure Soils Waters Vegetables, fruits Faeces Swimming waters Drinking water ?

Enterohemorrhagic [EHEC] / Verotoxigenic [VTEC] Escherichia coli en production primaire Dr Hein Imberechts Laboratoire Nationale de Référence pour les E. coli zoonotiques, santé animale

Contenu Définitions Clinique Virulence des VTEC VTEC chez les ruminants Le diagnostic Programmes officiels, monitoring Mesures Portage de VTEC en Belgique et en Europe

Définitions VTEC: produisent vérocytotoxines (VT), ou « Shiga toxins » (Stx) [voir Shigella dysenteriae] EHEC VTEC considéré très pathogène pour l’homme Mais: pas toujours HUS, HC (maladie grave)

Définitions E. coli O157 Non-O157: e.a. O26, O91, O103, O111, O145 Typique – atypique: réfère à la production des lésions A/E et (ou) la présence du plasmide EHEC E. coli zoonotiques - autres VTEC Problème de diagnostic

Clinique UE: 1.2 cas par 100.000 habitants (EFSA, 2005) Infection Aliments contaminés Eaux Contact direct & indirect: ruminants infectés Contact avec personnes infectées Clinique HUS, HC, BD Diarrhée, mal de ventre, sans symptômes

Virulence Facteurs de virulence Toxines Stx1, Stx2 Adhésines Eae Locus of Enterocyte Effacement Plasmide, Ehx (marqueur de virulence) Autres

Virulence LEE locus Nataro and Kaper 1998

Virulence Stx: encodé par phage, donc pas stable Variants

Virulence Séropathotype: combination de sérotype, stx subtypes, présence des facteurs de virulence et association avec maladie chez l’homme Seropathotype A strains (VTEC O157) have a high relative incidence, commonly cause outbreaks and are associated with HUS Seropathotype B strains (O26:H11, O103:H2/NM, O111:NM, O145:NM, O121:H19) have a moderate incidence and are uncommon in outbreaks, but were associated with HUS Seropathotype C strains (O91, O104 and O113 all of H-type 21) are associated with HUS, but these strains were of low incidence and rarely caused outbreaks Seropathotypes D and E are not HUS-associated and are uncommon in man or found only in non-human sources

Virulence « Deux lignées » de VTEC O157; une plus associée avec maladie chez l’homme Variants de Stx & pathologie Conclusion: à l’heure actuelle, on ne peut pas identifier une souche pathogène pour l’homme

VTEC chez les ruminants VTEC et diarrhée Souvent stx1 VTEC sans signes cliniques Implications pour le diagnostic et le monitoring

Le diagnostic Isolement E. coli O157 Autres mTSB+novobiocine; IMS (DynaBeads); CT-SMAC; agglutination Cefixime Tellurite Sorbitol MacConkey Méthode normalisée et validée (ISO 16654) Autres En développement Détection moléculaire: gènes appartenant à plusieurs souches

Le diagnostic Confirmation par sérotypie Antigène O: LPS, sucres Antigène H: flagelles, protéines Agglutination Confirmation par biochimie (O157) b-glucoronidase (négative) Sorbitol (fermentation lente)

Le diagnostic Confirmation par PCR Typage (tracing) Gènes: facteurs de virulence Polymorphismes Vérotoxines Stx1, Stx2 Adhésine Eae (a, b, g, …) Protéines du LEE Typage (tracing) PFGE: génome Stx1, Stx2 Phage

Le diagnostic Tests sérologiques (ELISA) Anti-O157 Anti-Stx Anti-Eae

Programme … … officiel en production primaire Avant 2005 Il n’y en a plus depuis 2005 Avant 2005 Détection à l’abattoir Tracing back de la ferme d’origine (Sanitel) Echantillonnage 20% entre 6 mois et 2 ans, aliment, poussière PCR Mesures d’hygiène sur la ferme

Programme Site de colonisation ? En fonction de Echantillonnage spécifique ? En fonction de la nourriture la saison … Plusieurs souches sur une exploitation

Monitoring Données comparables ? Evolution ? Infections chez l’homme & détection de VTEC pathogènes: la population animale les carcasses et viande à l’abattoir les échantillons environnementaux qui peuvent être contaminés par matière fécale et eaux ready to eat foods qui peuvent être contaminés par matières fécales Sérotypes: E. coli O157, O26, O91, O103, O111 et O145

Monitoring Recommandation EFSA Caractériser toute VTEC (animaux, aliments, environnement), par méthodes harmonisées Sérotypage Lysotypie (VTEC O157) Typage gènes vtx et eae Typage moléculaire PFGE Collection centralisée et comparaison des résultats

Monitoring chez les animaux L’isolement de VTEC indique la présence ubiquitaire dans l’environnement Bovins > moutons & chèvres > animaux de compagnie, faune sauvage, … >>> porc, volaille, … Tenir compte des différences locales La population Les pratiques agricoles La consommation alimentaire, …

Monitoring chez les animaux Problème: l’excrétion de VTEC O157 Transitoire Différences quantitatives Influencée par l’âge et l’alimentation Monitoring est lourd et cher Utile en cas de risque, p.ex. ferme ouverte au grand public

Mesures GHP à l’abattoir et à l’atelier de découpe, monitoring pour indicateurs comme Enterobacteriaceae et E. coli Procédures HACCP pour aliments susceptibles à être contaminés Monitoring des bovins, de la ferme, de l’aliment en cas d’études spécifiques Recommandation: d’abord E. coli O157, puis d’autres sérotypes, avec des méthodes harmonisées

Portage de VTEC EFSA: zoonoses, BIOHAZ Enternet PubMed http://www.efsa.europa.eu/EFSA/ Enternet http://www.hpa.org.uk/hpa/inter/enter-net_menu.htm PubMed http://www.promedmail.org/ AFSCA, Zoonotic agents in BE http://www.favv.be/home/pub/doc07/Report_TS_2005_S.pdf

Portage de VTEC Belgique Europe Peu de données, sauf aux abattoirs Chiffres sont confus

Escherichia coli entéro-hémorragique chez l’homme Christiane Duchesnes Janvier 2008

Escherichia coli Pathotype: EHEC Sérotypes: O157:H7; le plus fréquent O26, O103, O111, 0145, … Facteurs de virulence adhésion aux entérocytes et effacement des microvillosités sécrétion de toxines: Stx1 et Stx2 Réservoir Tube digestif de l’homme et de l’animal (ruminants) Contamination Ingestion: aliments contaminés par MF, crus ou peu cuits (hamburgers, produits à base de lait cru, légumes, …) Incidence Varie selon le pays; <2 cas/100 000 hab/an

Physiopathologie Diarrhée séro-sanglante Tube digestif www.cdc.gov/ncidod/eid/vol8no5/01-0385.htm. Diarrhée séro-sanglante Tube digestif EHEC Toxine Microangiopathies (surtout rénales)

Tableau clinique Tableau clinique Diarrhée sérosanglante Colite hémorragique Douleurs abdominales Peu de fièvre Cas groupés souvent liés à la restauration rapide

Traitement Complications Réhydratation Antibiotiques à éviter Complications Risques ++: enfants <3ans; adultes de >65 ans 10% Syndrome Hémolyse-Urémie (SHU) (incidence: 0,5 cas/100000 enfants<15ans /an) Rare Purpura thrombotique thrombocytopénique (PTT)

SHU (= HUS) MICROANGIOPATHIE (lésions endothéliales) INFLAMMATION Fragmentation des GR dans les lésions: anémie hémolytique Hb basse, réticulocytes et schizocytes Pâleur, (sub)ictère MICROTHROMBI Thrombopénie par consommation, pétéchies, purpura INSUFFISANCE RENALE AIGUË Oligo-anurie, oedèmes, prise de poids, hypertension artérielle, urémie

SHU traitement SHU évolution Symptomatique: Dialyse péritonéale ¾ cas évoluent vers la guérison < 5% mortalité Séquelles possibles: IRC HTA

Evaluation du risque lié aux VTEC et E Evaluation du risque lié aux VTEC et E. coli O157 entérohémorragiques dans les aliments en Belgique Georges Daube Université de Liège Faculté de Médecine Vétérinaire Microbiologie des Denrées Alimentaires Sart-Tilman, bât. B43bis 4000 Liège tél. 04-366.40.15 fax 04-366.40.44 http://www.mdaoa.ulg.ac.be/ Georges.Daube@ulg.ac.be Avec l’aide de : Katelijne Dierick, ISP

Plan de l’exposé Introduction Evaluation des risques Méthodes de recherche dans les aliments Appréciation du risque dans la filière « viande » Identification du danger Evaluation de l’exposition Caractérisation du danger Caractérisation du risque Mesures de prévention dans la filière « viande » Problématique des critères microbiologiques Conclusions

Evaluation des risques partie intégrante de l’analyse des risques Evaluation scientifique de la probabilité d’occurrence et de la gravité d’effets néfastes pour la santé résultant de l’exposition de l’homme à des dangers présents dans les aliments. Evaluation des risques Gestion des risques 1. Identification du danger 2. Evaluation de l’exposition Communication des risques 3. Caractérisation du danger 4. Caractérisation du risque

Principes des méthodes de recherche Pas de méthodes simples, standardisées et validées pour la recherche de VTEC non-O157 dans les aliments d’où pas de statistiques exploitables Aucune méthode disponible pour les dénombrements Pistes envisagées (recherches en cours) séparation immuno-magnétique basée sur le sérotype Besoin de milieux d’isolements spécifiques Besoin de confirmer la virulence

Principes des méthodes de recherche Propriétés biochimiques des E. coli O157:H7 semblables aux autres E. coli excepté: Résiste au tellurite et au céfixime Ne fermente pas le sorbitol en 24 h Ne produit pas de β-glucuronidase La sélection et la différentiation biochimique sont basées sur ces caractéristiques

Méthode-type de recherche de VTEC O157 dans les aliments Préenrichissement  Enrichissement  (Détection immunologique) Immuno-concentration (VIDAS ICE ou IMS-Dynal) Isolement Identification biochimique Agglutination Confirmation des facteurs de virulence par PCR

Schéma - Méthode Vidas ECO (1)

Schéma - Méthode Vidas ECO (2)

Concentration d’E. coli O157 par capture par des billes immunomagnétiques

Schéma - Méthode Vidas ECO (3) Confirmation

Centre de référence: UZ-Brussels Dr. Denis Pierard Détection des gènes codants pour les facteurs de virulence - Vérocytotoxines (shigatoxines stx1 et 2) - Entérohémolysine - eaeA (intimine)

EVALUATION QUANTITATIVE DU RISQUE DANS LA FILIERE VIANDE

1. Identification du danger 1.1. EHEC O157 terminologie Escherichia coli : espèce type du genre Escherichia appartenant à la famille des entérobactériacées. VTEC-STEC : E.coli vérocytotoxinogène ou producteurs de toxine « Shiga » souches produisant des toxines actives sur les cellules Véro (toxines VT ou stx). EHEC : E.coli entérohémorragique. E.coli vérocytotoxinogène qui possède les mêmes propriétés cliniques (SHU, entérocolite hémorragique), épidémiologiques et pathogéniques (propriétés attachantes/effaçantes, plasmide 60 MDa) que le clone épidémique O157:H7. EHEC O157 : E.coli entérohémorragique de sérotype O157. A l’origine de la définition du groupe EHEC et manifestant la plus forte vitulence et le plus fort potentiel épidémique.

1.2. Physiologie (1) Température: pH: Activité de l’eau (NaCl): Tmin : 6-7°C; Topt : 40°C; Tmax : 45,5°C D55°C : 20; D60°C : 3; D65°C : 0,36; (recommandation 70°C 2’) Pas ou peu d’effet de la congélation pH: pHmin : 4,2 (HCl) - 5,5 (Ac. acétique); pHopt : 6,9; pHmax : 9,4 Résistance/tolérance à l’acidité (adaptation) Activité de l’eau (NaCl): aWmin : 0,953; aWopt : 0,995 Conditionnement: Peu ou pas d’effet du sous-vide ou de l’atmosphère modifiée

1.2. Physiologie (2) Additifs: Rayonnements: Hautes pressions Ozone Nitrites: efficace à pH < 5,5 Acides organiques Bactériocines Phosphates Rayonnements: ionisation RX UV Hautes pressions Ozone

1.4. Symptomatologie

Résultat des surveillance VTEC en Belgique chez l’homme (2000-02) Serotype Freq % O157 4,018 65.3 O26 358 5.8 O103 347 5.6 O91 208 3.4 O145 109 1.8 O111 76 1.2 Serotype Freq % O146 60 1.0 O128 56 0.9 O113 39 0.6 O8 27 0.4 Other 859 14.0 Total 6,157 100.0 Data from 15 Enter-net countries

1.5. Mode de transmission Indirect Direct Consommation d’aliments contaminés : - denrées alimentaires d’origine animale (bovine) : « hamburgers » insuffisamment cuits (USA), salami, lait cru, produits laitiers non pasteurisés … - denrées alimentaires d’origine végétale Consommation d’eau de boisson contaminée. Baignade, pâture contaminée. Direct Transmission directe de l’homme à l’homme ou de l’animal à l’homme.

Modes de transmission AFSSA 2003

Aliments associés AFSSA 2003

Prévalence EHEC O157 en Belgique (source ULg, RUG, AZ-VUB et IEV) Coprocultures humaines: 1% EHEC et 0,2 % EHEC O157; lysotypes variés. Coprocultures bovines à l’abattoir : 6% EHEC O157 (1998-99). Carcasses de boeuf: en 1997 (400 cm2): 9/6010 (0,15 %); en 1999 (1.600 cm2 ): 16/1620 (1 %); en 2002 (1.600 cm2): 13/1215 (1,1%) en 2000 (1.600 cm2): 7/1501 (0,5%); en 2003 (1.600 cm2): 10/1479 (0,7%) en 2001 (1.600 cm2): 13/1388 (0,9%); en 2004 (1.600 cm2): 18/1319 (1,4%) Découpe de boeuf (25g) : en 2002: 0/222 (0%); en 2003: 2/285 (0,7%); en 2004: 2/244 (0,8%) Viande hachée de boeuf (25g) : en 1999: 1 / 984 (0,1%); en 2000: 1/487 (0,2%); en 2001: 0/298 (0%); en 2002 : 0/297 (0%); en 2003 : 5/298 (1,7%); en 2004 : 1/332 (0,3%) Autres viandes (veau, porc, volailles, lapins) : 0 EHEC O157 /1.500 Lait cru : 0/123 (2006); Fromage au lait cru de vache : 5/271 (1,8%) (2006)

Evaluations internationales

Evaluation du risque « viande hachée de bœuf » USDA 2001

2. Evaluation de l’exposition Principales étapes à envisager Contamination Contamination croisée Multiplication Dilution Destruction

2.1. Elevage La prévalence d’exploitations positives est très variable La prévalence intra-exploitations est aussi très variable Le type de bétail (veaux, taurillons, vaches) La dynamique temporelle dans les exploitations (effet alimentation, saison, etc.) L’excrétion à l’abattoir et sa dynamique temporelle sont similaires à celles observées dans les élevages

2.1. Elevage: données belges Informations manquantes - Collecter des informations concernant le type d’élevage et d’alimentation, l’âge des animaux, les saisons, les probiotiques, les immunisations et à partir de celles-ci en évaluer le risque différentiel. - Réaliser des études concernant le nombre de EHEC O157 / gr de matières fécales.

2.2. Abattoir: données belges Prévalence de carcasses contaminées sur 1.600 cm2 par EHEC O157 : 1,01 % (n = 8.522) Prévalence de carcasses contaminées sur 400 cm2 par EHEC O157 : 0.15 % (n = 6.010) Nombre de EHEC O157 : - 1 ufc/cm2 et 200 ufc/cm2. - 82% des + avec < 1 ufc/400 cm2. Nombre d’E. coli /cm2 : 95% < 100 ufc / cm2. 90% < 10 ufc / cm2. 70% < 1 ufc / cm2. 45% < 1 ufc / 10 cm2.

2.2. Abattoir: données belges Informations manquantes - Préciser les niveaux de contamination - Investiguer les facteurs de contamination croisée en fonction du type d’abattoir. Tenir compte de l’influence des fortes contaminations fécales accidentelles à l’abattoir.

2.3. Découpe et hachage: données belges La prévalence des morceaux de découpe contaminés par EHEC O157 est faible : 0,5% (n = 751). La prévalence de EHEC O157 dans la viande hachée de bœuf est de 0,3% (n = 2696). 75 % des viandes hachées de boeuf contiennent < 100 cfu/g

2.3. Découpe et Hachage: données belges Informations manquantes - Préciser l’importance relative des filières belges de production. - Déterminer en termes d’augmentation, de stabilisation ou de diminution de EHEC O157 l’influence des pratiques suivantes : L’utilisation ou non de la congélation avant le hachage.

2.3. Découpe et Hachage: données belges Le travail à partir de petits ou gros morceaux de découpe. Le nombre d’animaux différents intervenant au sein d’un même lot de hachage. L’utilisation ou non de chutes de découpe en boucherie. La possibilité de contamination d’origine humaine différente d’une filière à l’autre.

2.4. Stockage, Conditionnement et Distribution: données belges Température moyenne / filet américain / supermarchés : 5 °C. Température / comptoirs réfrigérés : 70% supermarchés : t°  7°C. DLC : 48 heures. Conditionnement : barquette en frigolite ou en plastique avec film perméable à l’air. Taille du conditionnement : 150 - 200 grs, 500grs. pH du filet américain préparé : 5 - 5.35.

2.5. Consommation: données belges Le % de conditionnements de viande hachée contaminés : 0 EHEC O157 sur 194 échantillons. La quantité de filet américain consommé / an : 2 kg 320. La consommation de hamburgers insuffisamment cuits est ignorée Le nombre estimé de consommateurs de filet américain: 5.329.485. La quantité estimée de filet américain consommé / repas : 150 g. Le nombre moyen de repas de filet américain par an : 15.

3. Caractérisation du danger Relation dose-réponse Dose infectieuse faible +/-50 cellules ingérées 4. Caractérisation du risque: données belges Carcasses de bœuf 1,01 % EHEC O157 + 0,82 % < 1 ufc/400 cm2 - 0,18 % > 1 ufc/400 cm2 Viande hachée de bœuf 0.30 % EHEC O157 + Population globale 10.192.264 42 cas de SHU (=1996) 4 cas mortels Nombre de repas / an 15 Taille de la portion consommée par repas 150 g

4. Caractérisation du risque: données belges

PREVENTION DU RISQUE DANS LA FILIERE VIANDE

Points essentiels à maîtriser Elevage :  portage,  niveau de portage. Abattage :  prévalence de carcasses contaminées,  niveau de contamination. Découpe, hachage :  prévalence et niveau de contamination en jouant sur congélation, quantité et origine de la viande de découpe. Stockage, conditionnement et distribution : respect strict de la chaîne du froid. Consommation : adopter le mode de consommation, respect de la chaîne du froid. Communication : stratégies de prévention : conseils pour acteurs de la filière et populations à risque.

Points essentiels à maîtriser Traitement des carcasses avec fortes contaminations fécales: Parage des contaminations visibles Déclassement des « accidents d’éviscération » Perte d’agrément pour « mauvais » abattoirs Tests systématique de carcasses pour « filet américain » Réduction du niveau de contamination par EHEC O157 en début de filière

Points essentiels à maîtriser Elevage :  portage,  niveau de portage. Abattage :  prévalence de carcasses contaminées,  niveau de contamination. Découpe, hachage :  prévalence et niveau de contamination en jouant sur congélation, quantité et origine de la viande de découpe. Stockage, conditionnement et distribution : respect strict de la chaîne du froid. Consommation : adopter le mode de consommation, respect de la chaîne du froid. Communication : stratégies de prévention : conseils pour acteurs de la filière et populations à risque.

Points essentiels à maîtriser Absence de consommation de viande crue de bœuf par les populations à risque: Enfants moins de 15 ans Personnes âgées

Critères microbiologiques Pas de critères dans le règlement (CE) N°2073/2005 Limites d’actions de l’AFSCA pour contrôles officiels:

Critères microbiologiques Avant de fixer des critères européens (DG SANCO) Avis 2007 de l’European Food Safety Authority (EFSA): Priorité = VTEC O157 Surveillance abattoir Surveillance chute de découpe Méthodes à développer pour VTEC non-O157

Conclusion Bonne connaissance de la prévalence, du niveau de contamination d’ E.coli O157 à tous les niveaux de production du filet américain. Comment établir un lien entre ces différentes étapes ? - Modélisation mathématique probabiliste. - Manque d’experts  indispensable pour définir les données adéquates à introduire dans le modèle. - Besoin  de données quantitatives. Prévention de EHEC au sein d’un aliment cru est difficile. - Mise en place de programmes d’assurance de sécurité alimentaire à chaque étape de production dont surtout l’abattoir: BPH - HACCP - Information du consommateur. Besoin de critères uniformes européens