Coques lactiques Métabolisme fermentaire  acide lactique Famille Steptococcaceae : Gram+, asporulés, immobiles, paires ou surtout en chaînes , catalase – (sauf Saccharococcus), aéro-anaérobies ou microaérophiles, exigences nutritives parfois complexes Rem : Certains Pédiocoques : pseudo-catalase ("peroxydase")  apparaissent catalase +

Coques lactiques Clé dichotomique des genres 1 – Fermentation du glucose sans gaz (homolactique) 1.1 Division cellulaire sur un plan donnant des paires et des chaînes : Streptococcus, Lactococcus, Enterococcus 1.2 Division cellulaire sur deux plans donnant des paires et des tétrades : Pediococcus 2. Fermentation du glucose avec gaz (hétérolactique) : Leuconostoc Tous ces genres sont catalase –

Coques lactiques Techniques isolement Streptocoques en général Lliquide : M17 (ou Terghazi), milieu Todd-Hewitt Solide : gélose au sang, trypticase soja + 5% sang, Columbia, yeast milk agar et M17 Ensemencement en surface et culture à 37°C Lactococcus Yeast milk agar , Terghazi (laiterie) Milieu lactosé gélosé au RN et au carbonate de calcium : acidification  dissolution des sels de calcium  petites colonies rouges foncées et zone éclaircissement du milieu

Coques lactiques Techniques isolement Streptococcus Bouillon bioStreptosel (Biomérieux), Bouillon de Holmes, gélose de Pike, Gélose sang-azide : caractère hémolytique Streptocoques (Mammites) : Edwards (sang, cristal violet et sulfate de thallium, esculine) à 37°C  colonies légèrement colorées Streptocoques oraux (gélose TYC) : haute teneur en saccharose pour différencier les colonies productrices de polysaccharides extracelluaires Enterococcus = streptocoques fécaux (entérocoques) Milieu Yeast peptone glucose Milieu de Barnes-Ingram (acétate de thallium et TTC)

Coques lactiques Techniques isolement Enterococcus Numération des streptocoques fécaux en milieu liquide (IAA) : milieu sélectif présomptif puis milieu sélectif confirmatif : Milieu de Rothe ou bouillon glucosé à l’azide (pas spécifique des steptocoques fécaux) milieu liquide de Litzky (azide et ethyl violet  plus spécifique) : tubes + = trouble et éventuellement pastille violette au fond du tube.

Coques lactiques Techniques isolement Leuconostoc 48 heures à 30°C Mayeux Sandine Elliker : isolement Leuconostoc en fromagerie (sélectif par concentration en saccharose 10%, citrate et azide, 21°C pendant 4 jours)  Leuconostoc = transparents, L. citrovorum = diamètre de 0,5 à 2 mm et reflet bleu; L. dextranicum = grande taille (1 à 5 mm) et gluantes L. oenos sur milieu spécial : milieu ATB Pediococcus Gélose Pediococcus ou milieu MRS : 22 ou 30°C Sélectivité MRS pH 5,5-5,7 et dans certain cas incubation à 43°C Incubation en anaérobiose (azote + 10% CO2) Gélose de Raka-Ray (brasserie) Pédiocoques halophiles : MRS pH 7 et 4 à 6% NaCl

Coques lactiques Identification Streptococcus, Lactococcus, Enteroccoccus Streptococcus : surtout nature immunologique Autres : tests biochimiques Groupage sérologique Test de Lancefield Caractère hémolytique 24 à 48 heures à 37°C, 24 heures à 4°C puis examen du type de l’hémolyse

Hémolyse a zone verdâtre 1 à 3 mm = hémolyse incomplète Hémolyse b zone claire sans changement de couleur Parfois autres types

Epreuve de CAMP Staphylocoque Epreuve de CAMP (streptocoques pathogènes) Mise en évidence de l’activité hémolytique sur des hématies de mouton en présence de toxine staphylococcique b Hémolyse est favorisée pour les souches de type B

Coques lactiques Identification Streptococcus, Lactococcus, Enteroccoccus Température de croissance De 10 à 45°C : 45°C de 24 à 48 heures; 10°C de 7 à 10 jours Parfois test à 50°C Croissance dans des conditions hostiles pH 9,6; 6,5% NaCl, bile, thermorésistance (60-63°C pendant 30 minutes)

Coques lactiques Identification Streptococcus, Lactococcus, Enteroccoccus Désamination de l’arginine Bouillon à l’arginine de 2 à 6 jours à 30°C  formation d’ammoniac mise en évidence par une goutte réactif de Nessler  coloration rouge Fermentation des sucres Tube de milieu base (eau peptonée + bleu de bromothymol) ou milieu cystine trypticase  ajout des sucres

Coques lactiques Identification Streptococcus, Lactococcus, Enteroccoccus Hydrolyse de l’hippurate, esculine Seul Streptocoque B : hydrolyse de l’hippurate en glycocolle et acide benzoïque : révélé par perchlorure de fer (brun) ou ninhydrine (bleu) Activités enzymatiques Pyrrolidonylarylamidase, leucine arylamidase, a et b galactosidase, b glucuronidase et phosphatase Production acétoïne Voges Proskauer

Coques lactiques Identification Streptococcus, Lactococcus, Enteroccoccus Recherche de la citratase Lait citraté : 30°C pendant 2 à 7 jours  fermentation se traduit par production gaz Hydrolyse de la gélatine, de l’amidon Charbon - Gélatine

Coques lactiques Identification Streptococcus, Lactococcus, Enteroccoccus Production de pigments Streptocoques B (S. agalactiae) et quelques streptocoques du groupe D  production pigment caroténoïde sur milieu spécifique pour mise en évidence pigment Production polysaccharides Bouillon ou gélose + 5% saccharose Galeries identification API 20 Strep, Rapid ID Strep…

Coques lactiques Identification Leuconostoc Deux principaux groupes : 1er produits laitiers et 2ème (= L. oenos) vin Caractérisation du genre : morphologie, caractère hétérofermentaire (mise en évidence sur Gibson-Ab El Malek ou Mac Cleskey) Caractérisation : proche de Streptococcus, sur les mêmes milieux et dans les mêmes conditions Hydrolyse de l’esculine, production de dextranes (colonies larges et gluantes) Oenococcus oeni (L. oenos) : croissance en présence de 10% éthanol

Coques lactiques Tests technologiques Caractère homo ou hétérofermentaire, comportement par rapport à la température, au pH, au NaCl, le pouvoir acidifiant et l’aptitude à la production de composés aromatiques. Homo ou hétérofermentaire Test de Gibson et Abd El Malek : dégagement de CO2 pour les hétérofermentaires Coques homofermentaires : que de l’acide lactique (95%) par fermentation du glucose Coques hétérofermentaires : acides lactique, acétique, formique, éthanol et CO2

Coques lactiques Tests technologiques Comportement par rapport aux conditions du milieu pH, température et NaCl Comportement vis-à-vis du rH par ajout d’indicateur d’oxydo-réduction Pouvoir acidifiant Flacon de 100 ml de lait ensemencé et incubé à 30°C : toutes les heures 5 ml de lait prélevés et titrés par soude Dornic (M/9 )  courbe d’acidification au cours du temps (1 degré dornic = 0,1 g acide / L de lait) Estimation plus rapide par mesure du pH après 24 heures Production de composés aromatiques Diacéthyle, acétaldéhyde, acétoïne dosés par HPLC Activité protéolytique Examen de lait tournesolé, dégradation de la caséine ou gélatine

Coques lactiques Tests technologiques Sensibilité aux antibiotiques Sensibilité aux bactériophages