Les risques microbiologiques des locaux Leur hygiène et leur contrôle

INTRODUCTION Hygiène insuffisante des locaux (en milieu hospitalier, dans les industries alimentaires, cosmétiques, pharmaceutiques….) : possibilité d’une contamination des personnes, des produits manipulés ou confectionnés  : Par de possibles germes pathogènes  Par des germes d’altération. 2

Conséquence de la contamination par de possibles germes pathogènes  Risques sanitaires avec de possibles infections ou intoxinations

- Intoxination : troubles dus uniquement à la production d’une toxine (souvent protéique) produite par le microorganisme contaminant et non pas dus au microorganisme - Infection : troubles dus à la multiplication du microorganisme (virulence) avec éventuellement production de toxines

Conséquences de la contamination par des germes d’altération Conséquences  pour les produits fabriqués : perte de valeur commerciale : altération des propriétés organoleptiques, perte de valeurs nutritionnelles diminution de la durée de conservation

Sources de contamination des locaux Air Homme Sol Eau Surfaces et équipements D’où nécessité que l’air ne soit pas trop riche en particules (supports de microorganismes) que l’eau soit de bonne qualité microbiologique que les surfaces, matériels soient nettoyés et désinfectés correctement, que les personnes respectent une bonne hygiène corporelle et les règles de port de leur tenue.  

Plan 1- Les diverses sources de contamination des locaux 2- Règles d’hygiène au niveau des locaux et leur mise en œuvre 3- Contrôle du respect des règles d’hygiène

1- Les diverses sources de contamination des locaux

1-1- Contamination de l’air

Comment expliquer ces différences ? Grands magasins (Paris) : 4 000 000 microorganismes/m3 d'air Grands boulevards : 575 000 microorganismes/m3 d'air Champs-Élysées : 88 000microorganismes/m3 d'air Parc Montsouris (boisé) : 1 000 microorganismes/m3 d'air Forêt de Fontainebleau : 50 microorganismes/m3 d'air Comment expliquer ces différences ?

Origine des microorganismes de l’air Milieux naturels (sol, eau …) Etres vivants (plantes, animaux, hommes). Modalités de transport des microorganismes dans l’air Particules atmosphériques et aérosols Particules d’origine humaine ou animale.

1-1-1- Transport des microorganismes par l’air

a/ Transport par poussières atmosphériques et aérosols Principe : les particules « collent » les microorganismes Donc, à tout moment, les microorganismes suivent le sort de ces particules quand elles sont véhiculées par l’air. Nature des particules - Poussières industrielles lourdes (100 à 400 mm) - Impuretés tombantes - Cendres volantes (2 à 20 mm) - Impuretés invisibles en suspension (0,2 à 0,8 mm) Remarque : Il existe environ 106 particules de diamètre supérieur à 5 mm par m3 d’air.

Les gouttelettes d’expectoration b/ Transport par des particules d’origine humaine ou animale Les squames Les gouttelettes d’expectoration

b/ Transport par des particules d’origine humaine ou animale Les squames - 3.107 particules de peau disséminées par jour et par individu - Particules de peau toutes porteuses de microorganismes.

b/ Transport par des particules d’origine humaine ou animale Les gouttelettes d’expectoration - Gouttelettes de Flügge : particules émises lors de la parole, de la toux ou de l’éternuement de diamètre de 5 à 100 mm, sédimentant rapidement - Droplet nucléi : résidus secs issus des gouttelettes de Flügge, de 0,5 à 12 mm, sédimentant lentement et donc assurant une dissémination à grande distance des microorganismes

Importance de la présence humaine dans la contamination d’un lieu

1-1-2- Facteurs influençant la qualité microbiologique de l’air d’un local

- Structure et qualité des matériaux du local (5%) - Taux d’occupation et activité des personnes présentes (80 %) - Type de local (15 %) - Structure et qualité des matériaux du local (5%)

Taux d’occupation et activité des personnes présentes - Plus il y a de personnes dans un lieu, plus la contamination est importante - Plus l’activité des personnes est grande et plus la contamination est importante Type de local - Est il ventilé ? - Nature de la ventilation ? - Présence de filtres HEPA ?

Structure et qualité des matériaux du local Idéal  : - Matériaux non poreux, faciles à nettoyer, ne permettant pas l’adhérence des poussières  - Murs et plafonds complètement lisses  - Absence de canalisations apparentes, et de prises  - Absence d’éclairage « suspendu » - Absence de joints apparents - Absence d’angles droits

1-1-3- Classes d’empoussièrement

Facteurs pris en compte dans la classification des locaux tenant pour définir les classes d’empoussièrement : taille des particules concentration des particules

Norme ISO 14644-1 : norme des classes d’empoussièrement Norme internationale

Norme US

norme internationale /norme US Correspondance norme internationale /norme US

Dans les industries agroalimentaires, exigence de la qualité de l’air En général ISO 6 (classe 1000) et ISO 7 (classe 10 000) Dans certains cas, ISO 5 (classe 100) pour les zones ultra sensibles Exemple Salle de tranchage d’un jambon : ambiance ISO 7 (de classe 10 000) avec, au niveau de chaque machine, une zone à flux laminaire ISO 5 (de classe 100)

Dans les blocs opératoires Chirurgie orthopédique : ISO 5 (zone 4) Chirurgie digestive : ISO 7 (zone 3) Salle de soins après intervention : ISO 8 (zone 2)

1-1-4- Nature des microorganismes présents

Nature des microorganismes de l’air - Bactéries résistant bien à la dessication : bactéries sporulées, Micrococcus, Staphylococcus, peu de Gram - - Moisissures : Aspergillus, Penicillium - Plus rarement des levures

- Bactéries résistant bien à la dessiccation : bactéries sporulées, Micrococcus, Staphylococcus, peu de Gram -

air - Moisissures : Aspergillus Penicillium

Difficultés pour contrôler la présence des microorganismes en suspension dans l’air Nécessité de travailler dans des lieux sans fenêtres ou fenêtres ne pouvant pas s’ouvrir, de ne pas oublier de fermer les portes, de contrôler les flux des matières, des produits et du personnel, d’utiliser des salles blanches pour les domaines sensibles aux contaminations (filtration de l’air et dépression ou surpression)

1-2- Contamination du sol

Flore du sol toujours importante : bactéries dans un sol riche représentent jusqu'à 12 tonnes à l'hectare ! Un gramme de terre prélevé peut contenir de 1 à 3 milliards de bactéries… et 100 millions de moisissures et levures…

Genres présents extrêmement variables Genres présents extrêmement variables. Exemples de bactéries les plus représentées - les Actinomycètes, - Pseudomonas, - et bien sûr les sporulés comme Bacillus, Clostridium, etc….. Présence également de moisissures et de levures D’où port de chaussures dédiées aux activités de travail, voire de surchaussures à usage unique

1-3- Contamination par les personnes

Origine de la flore de l’homme, source de contamination fréquente : - flore oro-pharyngée, flore commensale du tube digestif, flore cutanée

- goûtage d’aliments fabriqués, - mains sales (mouchages), Flore oro-pharyngée : Streptococcus, Staphylococcus, etc., contaminante par - toux, éternuements, - goûtage d’aliments fabriqués, - mains sales (mouchages), Conséquence : nécessité - du port de masques, - d’un lavage des mains après mouchage. - Environ 60% de la population porte Staphylococcus aureus au niveau de sa flore naso-pharyngée de façon transitoire - Environ 20% de la population porte Staphylococcus aureus au niveau de sa flore naso-pharyngée de façon constante.

- anaérobies (sporulés comme Clostridium ou non sporulés), Flore commensale du tube digestif Flore riche en - anaérobies (sporulés comme Clostridium ou non sporulés), - Entérobactéries (Escherichia coli et autres coliformes, Salmonella, Shigella), - Enterococcus - Staphylococcus aureus….., etc… Flore contaminante essentiellement par les mains sales si pas de lavage à la sortie des toilettes : contamination fécale. Conséquence : nécessité d’un lavage des mains systématique à la sortie des toilettes.

Flore cutanée Flore résidente - toujours présente sur la peau, - souvent organisée en micro-colonies en surface de la couche kératinisée, - impossible d'éliminer en totalité, - comprenant par exemple : Staphylococcus epidermidis et d'autres staphylocoques, Propionibacterium acnes, des corynébactéries, etc. Flore transitoire - non permanente, - issue des flores oro-pharyngées, commensales, etc. - pouvant être éliminée par des méthodes d'hygiène appropriées

Intérêt du lavage des mains pour éliminer la flore transitoire, Conséquence : Intérêt du lavage des mains pour éliminer la flore transitoire, mais Existence de limites du fait de la flore résidente, d’où la nécessité du port des gants pour certaines opérations.

1-4- Présence des bactéries dans l’environnement et biofilms

1-4-1- Qu’est-ce qu’un biofilm ?

Définition d’un biofilm : Communauté de microorganismes agrégés en microcolonies adhérant sur une surface, caractérisée par une sécrétion d’une matrice extra-cellulaire d’exopolymères (essentiellement polyosidiques) adhésive et protectrice.

1-4-2- Où se trouvent les biofilms ?

Partout

1-4-3- Comment les biofilms se forment ils ?

Étapes - Transport des microorganismes vers la surface - Adhésion non spécifique des microorganismes à la surface, puis adhésion spécifique des microorganismes à la surface - Colonisation : formation des microcolonies - Croissance : formation du biofilm - Dispersion

1-4-4- Conséquences de la formation des biofilms

Bactériens ou fongiques, les biofilms peuvent être à l’origine d’une contamination de nombreux individus par voie respiratoire, digestive ou par l’intermédiaire de matériel médical implanté

Dangerosité des biofilms microbiens pour la santé publique Exemple : plaque dentaire avec notamment Streptococcus mutans, au sein de nombreuses espèces constituant le biofilm et considéré comme le responsable majeur de la cariogénèse.

Contamination par voie respiratoire à partir de biofilms sur des surfaces inertes Lors de travaux sur des conduits de climatisation Par les pommes de douche Lors de la vie dans des locaux vétustes couverts de biofilms de moisissures

Contamination par voie digestive par des aliments contaminés à partir de biofilms Dans les récipients de stockage Dans les canalisations, les appareils de distribution de nettoyage difficile Sur les vitrines réfrigérées, les sachets de polyéthylène

Contamination par du matériel médical implanté Contaminations responsables d’infections nosocomiales

1-5- Conséquences de la présence des microorganismes de ces divers environnements : - contamination des produits fabriqués (aliments, médicaments, cosmétiques), - infections nosocomiales en milieu hospitalier

1-5-1- Contamination des aliments

a/ Évolution de la flore microbienne d’un aliment

b/ Risques encourus par la consommation d’aliments contaminés

Cas des TIAC (toxi-infection alimentaire collective)

1-5-2- Infection associée aux soins et infection nosocomiale

Infection associée aux soins : infection survenant au cours ou au décours d’une prise en charge (diagnostique, thérapeutique, palliative, préventive ou éducative) d’un patient, si elle n’était ni présente, ni en incubation au début de sa prise en charge. Infection nosocomiale : affection associée aux soins contractée dans un établissement de santé

2- Règles d’hygiène et leur mise en œuvre

Pour limiter les apports microbiens : De façon générale, respecter les bonnes pratiques d’hygiène en ce qui concerne : les locaux les matériels les personnels respecter la marche en avant, En outre, dans les industries agro-alimentaires : - utiliser des matières premières peu contaminées, - mettre en place une démarche HACCP

2-1- Règles générales d’hygiène

Exigences concernant les locaux et leurs annexes : dimensions suffisantes pour que les activités professionnelles puissent s’y exercer dans des conditions d’hygiène convenables. surfaces facilement nettoyables et désinfectables et bonne aération.

2-1-1- Hygiène des locaux : opérations de nettoyage - désinfection

a/ Les diverses opérations Le nettoyage Définition : opération ayant pour but d’éliminer les souillures visibles à l’aide de produits de nettoyage (détergents, agents anioniques, cationiques…) afin : - d’éliminer toute source de nutriments - d’éliminer les matières organiques susceptibles d’inhiber l’action du désinfectant. Nettoyage : - responsable de la propreté physique - préalable à la désinfection.

La désinfection Désinfection = opération au résultat momentané, permettant d’éliminer ou de tuer les microorganismes, et/ou inactiver les virus indésirables portés par des milieux inertes contaminés en fonction des objectifs fixés. Désinfectant = Agent antimicrobien à large spectre qui agit sur les surfaces inertes La désinfection assure la propreté microbiologique.

Le rinçage Opération destinée à éliminer toute trace de produit désinfectant, sans apporter une nouvelle souillure ou de nouveaux germes. Il assure la propreté chimique.

b/ produits de désinfection Nécessité de disposer de désinfectants et/ ou de détergents désinfectants adaptés et utilisés à la bonne concentration Nécessité de désinfectants et détergents- désinfectants répondant aux exigences des normes AFNOR.

c/ matériels pour les opérations de nettoyage - désinfection Matériel utile à proximité de la zone où a lieu le nettoyage et/ ou la désinfection, regroupé sur un chariot dont l’organisation doit être rigoureuse Ou situé au niveau de la centrale de nettoyage / désinfection. Sur ce chariot, présence  : de seaux de couleur différentes pour mettre détergents, désinfectants, détergents – désinfectants, de balais (balais trapèze, balais réservoirs), de gants (gants de ménage nominatifs, gants à usage unique), de sacs poubelle (sacs pour déchets ménagers, sacs pour DASRI* en milieu hospitalier), de petit matériel (papier toilette, gaze à usage unique). * DASRI : Déchets d’activités de soins à risque infectieux.  

Existence de divers types de chariots avec matériel - en parfait état, - entretenu après utilisation (nettoyé-désinfecté) - le plus possible à usage unique.

2-1-2- Hygiène du matériel

Nécessité de privilégier des matériels avec : des surfaces lisses et non poreuses des arrondis avec un rayon suffisant pour faciliter le nettoyage aucune surface de stagnation d’eau des matériaux limitant l’adhésion microbienne (privilégier les matériaux hydrophiles comme verre et métaux aux matériaux hydrophobes comme les plastiques).

2-1-3- Hygiène du personnel

Ainsi, toute personne présentant une maladie transmissible, ou porteuse de bactéries pathogènes ou de parasites ne peut, jusqu’à guérison ou élimination du portage, occuper un emploi au contact des denrées alimentaires et doit éviter le contact avec des patients ou des personnes fragiles. Des contrôles doivent être effectués régulièrement sur les personnels.

Tenue vestimentaire et propreté des mains en industrie agroalimentaire Passage par un vestiaire et mise d’une tenue adéquate à sa fonction (pantalon, tunique, chaussures, et selon le lieu de la chaîne de fabrication : coiffe couvrante, masque, gants).

Tenue vestimentaire et propreté des mains en industrie agroalimentaire Lavage des mains avec un savon bactéricide : à chaque reprise de travail après un passage aux toilettes après toute opération susceptible de les contaminer (éternuement, se moucher, épluchage…)

Tenue vestimentaire du personnel soignant (milieu hospitalier) -Tenue standard - Tenue additionnelle si nécessaire

2-2- Règles supplémentaires pour une bonne hygiène des aliments

2-2-1- Respect de la marche en avant

2-2-2- Respect des températures en liaison chaude et en liaison froide

Influence de la température sur la multiplication microbienne

2-2-2- Mise en place d’une démarche HACCP Système qui identifie, évalue et maîtrise les dangers significatifs potentiels au regard de la sécurité des aliments afin d’assurer la sécurité du consommateur. 2-2-2- Mise en place d’une démarche HACCP

Pré-requis pour la mise en place de la démarche HACCP BPH encore appelées : «Programmes pré-requis : PRP  » (Codex) «Programmes préalables » (ISO 22000) Conditions, activités de base nécessaires pour maintenir tout au long de la chaîne alimentaire un environnement hygiénique approprié à la production, à la manutention et à la mise à disposition des produits finis sûrs pour la consommation. Mesures de maîtrise de base prises par les professionnels pour assurer l’hygiène alimentaire.

Les Bonnes Pratiques d’hygiène Hygiène du personnel Matériel et locaux adaptés Nettoyage et désinfection Gestion des déchets Lutte contre les nuisibles Eau, air, éclairage Maintenance Maîtrise des températures Contrôle à réception Stockage Transport Marche en avant … Dans les BPH, on retrouve les éléments concernant :

La méthode HACCP Caractéristiques - Spécifique à l’ alimentaire - Préventive 7 principes d’action Principes établis/précisés par codex alimentarius en 1997 et repris dans 852/2004.

Les 7 principes fondamentaux de l’HACCP Composition du produit Stockage et distribution Matières premières Production Conditionnement Consommateur HACCP 1) Dangers biologiques 2) Dangers physiques 3) Dangers chimiques Principe n°1 : Identification des dangers Principe n°2 : Détermination des CCP Principe n°3 : Établissement des limites critiques Principe n°4 : Mise en place d'un système de surveillance HACCP permet maîtrise des dangers …. grâce à 7 principes successifs. Le premier est identification / étude et analyse des …. (Identifier les dangers associés à une production alimentaire, à tous les stades de celle-ci ) Ceci aboutit au deuxième principe = déterm des Points Critiques pour la Maîtrise de ces dangers (CCPs ou Critical Control Points). 3- Établir les limites critiques (critères opérationnels) dont le respect atteste de la maîtrise effective des CCPs. 4- Établir et mettre en place un système de surveillance permettant de s'assurer de la maîtrise effective des CCPs. 5- Imaginer les actions correctives à mettre en oeuvre lorsque la surveillance révèle qu'un CCP donné n'est pas (ou n'est plus) maîtrisé. 6- Établir les procédures spécifiques pour la vérification, destinée à confirmer que le système HACCP fonctionne efficacement. 7- Établir un système documentaire (procédures et enregistrements) approprié pour montrer qu'on surveille efficacement. Principe n°5 : Actions correctives Principe n°6 : Vérification-validation Principe n°7 : Système documentaire 106 106

Mise en œuvre Par ou commencer ?? C’est la principale difficulté En utilisant une méthode de mise en œuvre des 7 principes de l’HACCP, précédée par 5 étapes : les 12 étapes du Codex Alimentarius 107 107

Les 12 étapes de l’HACCP : le plan de travail 1. Constituer une équipe HACCP 2. Décrire le produit 3. Déterminer son utilisation prévue 4. Établir le diagramme des opérations 5. Vérifier sur place le diagramme Phases préliminaires Ces 12 étapes permettent de mettre en œuvre les principes de l’HACCP : les 5 premières sont des étapes préliminaires et les 7 suivants reprennent les principes et permettent successivement l’analyse des dangers ; la maitrise des CCP la vérif et la doc.

« Diagramme de fabrication » : ensemble des étapes de fabrication du produit, depuis la ou les matières premières jusqu’à l’utilisation plausible du produit par le consommateur, selon leur ordre chronologique.

Les 12 étapes de l’HACCP : le plan de travail 1. Constituer une équipe HACCP 2. Décrire le produit 3. Déterminer son utilisation prévue 4. Établir le diagramme des opérations 5. Vérifier sur place le diagramme 6. Énumérer tous les dangers potentiels Effectuer une analyse des risques Répertorier toutes les causes Prendre des mesures préventives Phases préliminaires Analyse des dangers Principe 1

Les 12 étapes de l’HACCP : le plan de travail 1. Constituer une équipe HACCP 2. Décrire le produit 3. Déterminer son utilisation prévue 4. Établir le diagramme des opérations 5. Vérifier sur place le diagramme 6. Énumérer tous les dangers potentiels Effectuer une analyse des risques Répertorier toutes les causes Prendre des mesures préventives 7. Déterminer les CCP 8. Fixer une limite critique pour chaque CCP Phases préliminaires Analyse des dangers Principe 1 Caractérisation des points critiques Principe 2 Principe 3

Arbre et tableau de décision pour la détermination des CCP (principe 2) Étape/ intrant Danger identifié Q1 Q2 Q3 Q4 CCP

Les 12 étapes de l’HACCP : le plan de travail 1. Constituer une équipe HACCP 2. Décrire le produit 3. Déterminer son utilisation prévue 4. Établir le diagramme des opérations 5. Vérifier sur place le diagramme 6. Énumérer tous les dangers potentiels Effectuer une analyse des risques Répertorier toutes les causes Prendre des mesures préventives 7. Déterminer les CCP 8. Fixer une limite critique pour chaque CCP 9. Mettre en place un système de surveillance 10. Prendre des mesures correctives Phases préliminaires Analyse des dangers Principe 1 Caractérisation des points critiques Principe 2 Principe 3 Ces 12 étapes permettent de mettre en œuvre les principes de l’HACCP : les 5 premières sont des étapes préliminaires et les 7 suivants reprennent les principes et permettent successivement l’analyse des dangers ; la maitrise des CCP la vérif et la doc. Principe 4 Vérification du système HACCP Principe 5

Nature du système de surveillance observation visuelle (tenue vestimentaire correcte, absence de résidus sur les surfaces) ou mécanique (passage au détecteur de métal), - mesure physique ou chimique (mesure de température), - test microbiologique (ATP métrie, gélose contact). Surveillance continu: à l’aide de capteur relié à un ordinateur assurant une mesure en permanence Mesure en discontinu: personne faisant une mesure à un instant t

Les 12 étapes de l’HACCP : le plan de travail 1. Constituer une équipe HACCP 2. Décrire le produit 3. Déterminer son utilisation prévue 4. Établir le diagramme des opérations 5. Vérifier sur place le diagramme 6. Énumérer tous les dangers potentiels Effectuer une analyse des risques Répertorier toutes les causes Prendre des mesures préventives 7. Déterminer les CCP 8. Fixer une limite critique pour chaque CCP 9. Mettre en place un système de surveillance 10. Prendre des mesures correctives 11. Appliquer des mesures de vérification Phases préliminaires Analyse des dangers Principe 1 Caractérisation des points critiques Principe 2 Principe 3 Ces 12 étapes permettent de mettre en œuvre les principes de l’HACCP : les 5 premières sont des étapes préliminaires et les 7 suivants reprennent les principes et permettent successivement l’analyse des dangers ; la maitrise des CCP la vérif et la doc. Principe 4 Vérification du système HACCP Principe 5 Principe 6

Moyens mis en œuvre pour la vérification : Pour la vérification de la mise en place effective - Audit interne des pratiques afin de s’assurer que les procédures à suivre sont bien connues Audit interne des enregistrements afin de s’assurer qu’ils sont bien remplis et exploités Vérification du traitement des produits non conformes (ont-ils été bien gérés ?) Pour la vérification de l’efficacité du système - Challenge test - Analyses sur le produit - Réclamations clients - Existence de non conformités internes, crises

Les 12 étapes de l’HACCP : le plan de travail 1. Constituer une équipe HACCP 2. Décrire le produit 3. Déterminer son utilisation prévue 4. Établir le diagramme des opérations 5. Vérifier sur place le diagramme 6. Énumérer tous les dangers potentiels Effectuer une analyse des risques Répertorier toutes les causes Prendre des mesures préventives 7. Déterminer les CCP 8. Fixer une limite critique pour chaque CCP 9. Mettre en place un système de surveillance 10. Prendre des mesures correctives 11. Appliquer des mesures de vérification 12. Constituer des dossiers et tenir des registres Phases préliminaires Analyse des dangers Principe 1 Caractérisation des points critiques Principe 2 Principe 3 Ces 12 étapes permettent de mettre en œuvre les principes de l’HACCP : les 5 premières sont des étapes préliminaires et les 7 suivants reprennent les principes et permettent successivement l’analyse des dangers ; la maitrise des CCP la vérif et la doc. Principe 4 Vérification du système HACCP Principe 5 Principe 6 Documentation du système HACCP Principe 7

Enregistrements à conserver : preuve de l’application du plan HACCP Étape 12 : Mise en place d’un système documentaire Principe 7 Contenu de la documentation : description du système HACCP : plan HACCP tous les documents permettant de prouver que les dispositions prévues sont bien respectées : enregistrements se référant aux points 1 à 11 (résultats, observations…) Enregistrements à conserver : preuve de l’application du plan HACCP

Paramètre de surveillance Danger Etape CCP Paramètre de surveillance Limite critique = valeur cible + tolérance Surveillance Actions correctives Modalités références Cause de perte de maîtrise Documents

Conclusion : les raisons d’utiliser l’HACCP Pour prévenir des problèmes potentiels et éventuellement existants Pour assurer la sécurité des denrées alimentaires et donc des consommateurs Pour se conformer aux exigences règlementaires et / ou normatives Pour répondre aux exigences des clients

3- Contrôle du respect des règles d’hygiène et de leur efficacité

3-1- Contrôle de l’air

Existence de 2 types de méthodes  Méthodes non microbiologiques : méthodes de contrôle particulaire  Méthode dynamique par comptage de particules dans un volume d’air collecté Méthodes microbiologiques : méthodes de contrôle de l’aérobiocontamination Méthode dynamique : attraction d’air et impactation sur milieu gélosé Méthode statique : sédimentation sur milieu gélosé en boîte de Pétri

3-1-1- Méthodes non microbiologiques

Principe : Comptage par des méthodes optiques du nombre de particules de diamètre supérieur ou égal à 0,5 mm à l’aide d’un compteur de particules Intérêt : Déterminer la classe d’empoussièrement

3-1-2- Méthodes microbiologiques

Principe : dénombrement des p. n. c Principe : dénombrement des p.n.c. : particules donnant naissance à des colonies. Comptage pouvant être réalisé par des méthodes statiques ou dynamiques

a/ Méthodes statiques Principe : Laisser déposer les particules de l’air à la surface d’un milieu gélosé contenu dans une boîte laissée ouverte pendant 10 minutes. Avantage : méthode simple ne nécessitant aucun dispositif particulier. Inconvénients : - Ne donne que des résultats qualitatifs - Donne des résultats aléatoires car dépendant des turbulences de l’air dans la zone examinée (un air pollué mais en courant ascendant donnera 0 p.n.c.).  

b/ Méthodes dynamiques Principe : Aspiration quantitative d’un volume connu d’air et collecte des bactéries de ce volume dans un milieu liquide ou solide soit directement dans le milieu soit indirectement sur une membrane filtrante dont les pores ont un diamètre de 0,22 mm).

b/ Méthodes dynamiques Milieux de culture : fonction des germes à dénombrer Températures d’incubation  : - 20°C pour la culture de tous les germes banaux de l’atmosphère, - 37°C pour la culture des bactéries pathogènes pour l’homme, - 10°C pour la culture des microorganismes des bactéries d’une chambre froide. Nécessité de faire les lectures chaque jour pendant au moins 3 jours.

Intérêt : Donner le nombre de microorganismes par m3 d’air aspiré (aspect quantitatif) et comparer aux résultats attendus en fonction de la classe bactériologique attendue. - Donner le nom des microorganismes (aspect qualitatif). Norme NF S90-351

3-1-3- Comparaison des 2 méthodes

Permet en plus l’identification des microorganismes présents

3-2- Contrôle des surfaces Contrôle des surfaces en milieu hospitalier Norme ISO 14 698 -1 Norme ISO 14 698 - 2 3-2- Contrôle des surfaces

Contrôle reposant sur des prélèvements effectués sur la surface à traiter. Contrôle permettant : de révéler la nature de microorganismes présents d’évaluer le degré de contamination. Selon les résultats obtenus, validation ou non de la procédure de nettoyage et de désinfection mise en œuvre.

Prélèvements effectués - généralement quelques heures après l’opération de nettoyage et de désinfection - de façon régulière (toutes les semaines par exemple). Suivi de la qualité microbiologique ainsi réalisé semaine après semaine et dès que la qualité descend en dessous d’un seuil acceptable, il faut déclencher des actions correctives afin de rétablir un bon niveau de qualité microbiologique (exemple dans les industries alimentaires plan HACCP = Hazard analysis critical control point)

3-2-1- Les techniques de prélèvement

Mise en œuvre possible de deux méthodes afin de détacher les germes présents sur une surface : Le frottement d’un écouvillon sur une surface connue bien délimitée L’adhérence sur milieu gélosé (Ex Boîte contact, Pétrifilm)

a/ La technique d’écouvillonnage Principe : - détacher à l’aide de l’écouvillon tous les microorganismes présents sur une surface donnée et les recueillir sur l’écouvillon - les remettre en suspension dans un volume connu de diluant et les mettre ensuite en culture en milieu gélosé.

Humidifier l’écouvillon Définir la surface à écouvillonner Technique Humidifier l’écouvillon Définir la surface à écouvillonner Prélever en stries parallèles rapprochées tout en tournant l’écouvillon lentement Répéter ce prélèvement en réalisant des stries perpendiculaires aux précédentes Mettre l’écouvillon dans un liquide approprié et bien agiter. Analyser  Nettoyer la surface écouvillonnée pour éliminer tout résidu nutritif.

Avantage : technique permettant le prélèvement dans un endroit peu accessible, sur n’importe quelle surface, pas forcément plane.

b/ Technique de prélèvement par contact Principe : détacher les microorganismes d’une surface et les faire passer directement sur la surface d’un milieu gélosé au niveau duquel chaque bactérie va se multiplier et donner 1 colonie.

Technique utilisant  soit des boîtes contact soit des lames gélosées

Contraintes Nécessité : d’ une bonne planéité de la surface prélevée et de la gélose - d’ une hydratation suffisante de la gélose. Technique : - Appliquer le milieu de culture sur la surface * pendant quelques secondes (10 secondes) * en exerçant une pression uniforme et constante sur toute la surface * sans mouvement circulaire ou linéaire - Nettoyer ensuite la surface échantillonnée afin d’éliminer tout résidu nutritif.

3-2-2- Comparaison des 2 techniques

3-2-3- Limites des 2 techniques

3-3- Contrôle de l’hygiène du personnel

Contrôle par écouvillonnage ou lames contact de : - l’hygiène des mains - l’hygiène de la tenue. Principe et techniques mis en œuvre les mêmes que pour le contrôle des surfaces.